پژوهنده )مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي(
تاريخ دريافت مقاله: 13/11/1392 سال نوزدهم، شماره 6بهمن ، و پي در اسفند پي3 131029، صفحات 294 تا 303 تاريخ پذيرش مقاله: 21/8/1393
بهينهسازی اثر اعمال فراصوت و افزودن گلوکز بر ميزان رشد سلولي
ساکارومايسس سرويزيه )PTCC 5269( با روش پاسخ سطح) RSM(
محمد مهدی قليان*1، رضا رضائيمکرم2، محمد امين حجازی3، محمود صوتيخياباني2، حامد هميشهکار4، فاطمه زندهبودی5، فيروزه صفائيان6

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد الیگودرز، باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان، الیگودرز، ایران
گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز ،ایران
پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی شمال غرب و غرب کشور، تبریز، ایران
مرکز تحقیقات کاربردی دارویی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز ،ایران
گروه علوم و صنایع غذایی، پژوهشکده علوم و صنایع غذایی مشهد ،مشهد ،ایران
-10921208627

دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران چکيده
سابقه و هدف: ساکارومایسس سرویزیه، تخمیرکنندهی قوی است کهه کهارایی بسه یار بها یی در صهنتت تخم یه ر و تولیه د محصهو تتخمیری دارد. روشهای متتددی برای افزایش میزان رشد و توده سلولی این مخمر وجود دارد ،یکی از این روشها استفاده از فراصهوتمیباشد. تحریک فراصوت با شدت پایین، باعث تحریک افزایش خروج آنزیم از دیه وارهی سهلول ی شهده و مهیتوانهد نفوذپهذ یری غشها وسرعت انتقال مواد را بهبود بخشد و رشد و تولید مثل سلولها را بهینه کند. در نتیجه، کاربردی مناسب در افزایش رشد مخمر و تولیه د پروتئین تک سلولی خواهد داشت. هدف پژوهش حاضر، بهینهسازی اثر اعمال فراصوت با شدت پایین، بر رشد سلولی مخمر بود.
مواد و روشها: در این تحقیق از مخمر ساکارومایسس سرویزیه )5269 PTCC( استفاده شد. بهینهه سهازی تهوان ) 2، 6 و 10 وات( و زمان) 10، 20 و 30 ثانیه( اعمال امواج فراصوت با شدت پایین و میزان غلظت گلوکز) 5، 10 و 15% حجمی- حجمی( در محیط کشت مخمر، بر راندمان رشد سلول، با استفاده از روش سطح پاسخ) RSM( مورد بررسی قرار گرفت.
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

يافتهها: شرایط عملکرد بهینه حاصل از روش RSM، توان فراصوت 6 وات، زمان اعمال فراصوت 20 ثانیه و افزودن 10 درصهد گلهوکزبود .کمترین و بیشترین میزان وزن خشک مخمر، به ترتیب 1/9 و 3/43 میلیگرم مشاهده شد.
نتيجهگيری: نتایج نشان داد که میزان وزن خشک با اعمال فراصوت افزایش مییابد. بیشترین تودهی سلولی مخمر پس از اعمال تهوانو زمان متوسط امواج فراصوت بهدست آمد. نمونهی تیمار شده با فراصوت، در مقایسه با نمونهههای تیمهار نشهده بها فراصهوت، افهزایشمتنیداری را در وزن خشک مخمر، از خود نشان داد. با افزایش رشد سلولی، شرایط برای استفاده از مخمر ساکارومایسس سهرویزیه بههعنوان پروتئین تک سلولی با توجه به خواص پروبیوتیکی این مخمر، بهینه شد.

-18287235558

واژگان کليدی: تودهی زیستی ،فراصوت ،ساکارومایسس سرویزیه لطفاً به این مقاله به صورت زیر استناد نمایید:
Gholian MM, Rezaei Mokarram R, Hejazi MA, Sowti Khiabani M, Hamishehkar H, Zendeboodi F, Safaeian F.
Optimization of the effect of ultrasound and glucose added on the Saccharomyces cerevisiae PTCC 5269 biomass using response surface methodology (RSM). Pejouhandeh :)6(91;5102294-303.
629925242

مقدمه1
روشهای فرآینهد و نگههداری غیرسهنتی ، بهه دلیهل بهبهود جنبههای تغذیهای و حسی، سهادگی اسهتفاده ، عهدم نیهاز بهه افزودنیهای سنتزی، مصرف انهرژی پهایین و ایمنهی زیسهت –

*نويسنده مسؤول مکاتبات: محمد مهدی قليان؛ دانشگاه آزاد اسهلامی، واحهد الیگهودرز، بهاشهگاه پهژوهشگران جوان و نخبگان، الیگودرز، لرستان ،ایه ران ؛ تلفهن:
[email protected] :؛ پست الکترونيك09163646431
محیطی، به سرعت در حهال گسهترش مهی باشهند . بهه عهلاوه ، تقاضای مصرفکننده برای غذای تازهتر، طبیتیتر و سالمتر که ایمنی با تری را فراهم کند، سبب افزایش علاقه به اسهتفاده از روشهای غیرحرارتی در فرآوری مواد غذایی شهده اسهت )1(. استفاده از فراصوت در فرآوری مواد غذایی، به سرعت در حهال گسترش است .امواج فراصوت، بهه امهواج بها فرکهانس بهیش از20- 18 کیلوهرتز اطهلا مهیشهود کهه توسهط انسهان قابهلشناسایی نیستند. ایهن امهواج، در دو محهدوده ی امهواج داراى فرکانس با و توان پایین و امواج داراى فرکانس پایین و تهوان با طبقهبندی میشوند) 2(. شوک فراصوت تهوان بها ، سهببکاهش لگاریتمی مخمر شده و برای حهذف میکروارگانیسهمههاکاربرد دارد .فراصوت توان پایین، در محدودهی فرکهانس 1 تها10 مگ اهرتز م یباش د ک ه ب ه آن فراص وت تشخیص ی نی ز
میگویند. از امواج فراصهوت بها تهوان پهایین ، بهه عنهوان روش تجزیهای در تهیه اطلاعات مربوط بهه ویژگهی ههای فیزیکهی و شیمیایی مواد غذایی استفاده مهی شهود . در ایهن حالهت ، تهوان بهکار رفته به حدی پایین است که پس از قطع امواج فراصوت، تغیی ری در خ واص فیزیک ی و ش یمیایی موادغ ذایی ایج اد نمیشود. در نتیجه، بهه ایهن تکنیهک ، غیرمخهرب مهی گوینهد . بهکارگیری شوک فراصوت توان پایین، میتواند سبب پیشرفت و تحری ک اف زایش خ روج آن زیم از دی وارهی س لولی ش ده و پیشبینی میشود که ه از ایهن طریهق باعهث افهزایش بهازدهیفرآیند تخمیری شود. با توجه به این تحقیقات، فراصوت تهوانپ ایین م یتوان د ب ه عن وان ی ک اب زار مناس ب ب رای بهب ود فرآین دهای بیوتکنول وژیکی عم ل کن د )3(. فراص وت ب رای استخراج و افزایش خروج بسیاری از آنزیمهای درون سلولی، از قبیل خروج انورتاز از ساکارومایسهس سهرویزیه )4،5(، خهروجانورته از از Phaffia rhodozyma )6(، خهههروج انورتهههاز از Aspergillus niger )7(، خ روج آن زیم فس فاتاز اس یدی و ATP-ase از ساکارومایسههس سههرویزیه )8( و خههروج آنههزیمبتاگا کتوزیداز از کتوباسهیلو هها اسهتفاده شهده اسهت. در تحقی ق فرانک و و همک اران، تیم ار فراص وت ب ا فرک انس 24 کیلوهرتز به مدت روزانه 5 دقیقه، موجب افزایش نهر رشهد و میه زان ته ودهی سه لولی نهه ایی در سهیانوباکتریوم آنابنها )[Anabaena flos-aquae [Cyanobacteria( شههد )9(. همچنین در مطالتهی چو و همکاران، اعمال فراصوت به مهدت150 ثانیه با فرکانس 25 کیلوهرتز روی Micromonosporaechinospora، موجهه ب افهه زایش 76 درصهه دی تولیهه د جنتامایسین درون سلولی شد )10(. مطالتات نشهان مهیدههد اعمال فراصوت در شهرایط مناسهب، موجهب تسهریع در رشهدسلولی و افزایش تولید محصو ت تخمیر در بیشتر موارد شهدهاست. مخمر را میتوان قهدیمی تهرین میکروارگانیسهم صهنتتیشه ناخته شه ده توسه ط بشه ر در نظه ر گرفه ت. مخمرهه ا یوکاریوتهایی تکسلولی هسهتند کهه در فرمهانرو قهارا هها وشاخهی آسکومیستها دستهبندی میشوند )11(.
ساکارومایسس سرویزیه تخمیرکنن دهی ق وی اس ت ک ه کارایی بسیار با یی در صهنتت تخمیهر دارد و در حهین رشهد،مقدار زیادی گاز دیاکسیدکربن تولید کرده و به سطح محهیطکشت میآید و به همهین دلیهل بهه آن مخمهر سهطحی )top yeasts( نیز میگویند. شکل ظاهری آنها بیضوی، کهروی و یهامستطیل کشیده است که در انتها، گرد به نظهر مهیرسهند . در بتضی شرایط، سلولها بهدنبال هم قرار گرفته و یک میسیلیوم کاذب ابتهدایی ، ایجهاد مهی کننهد. تولیهد مثهل آنهها، بها ایجهادجوانههای قطبی در سلولها و یا به صهورت تولیهد آسکوسه ورصورت میگیرد. ایهن مخمهر بهه دلیهل خهواص اسهتراتژیک وقابلیتهایی که در تولید پروتئین تهک سهلولی دارد، ههمردهی پروبیوتیکها قرار گرفته و افزایش تتداد و وزن خشک آنهها، از اهمیت خاصی برخوردار است )12(. با توجه به مطالتهات ذکهرشده و ویژگیهای مخمر، پژوهشی به جهت بهینهه سهازی اثهراعمال فراصوت شدت پایین بر رشد سلولی مخمر، انجام شد.

مواد و روشها
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

میکروارگانیسههم مههورد نظههر، ساکارومایسههس سههرویزیه PTCC5269، انتخاب و به صورت آم ول لیهوفلیزه از سهازمانپژوهشهای علمی و صنتتی ایران، دریافت شد. مخمهر جههتآمادهسازی در شهرایط اسهتریل در 100 میلهی لیتهر از محهیطکشت مایع Potato dextrose broth( PDB( فتالسازی شد )13(. برای این منظهور ، از دمهای 37 درجههی سهانتی گهراد ولرزانندهی 100 دور در دقیقه اسهتفاده شهد. جههت نگههداریمخمره ا، از محههیط کشههت جامههد شههیبدار )PDA )slant )Potato dextrose agar( و گرمخانهگهذاری در انکوبهاتور در دمای 37 درجهی سانتیگراد، استفاده گردید )14(. بهرای اثهرافزودن قند ،گلوکز +D تهیه و برحسب درصدهای مهورد نظهر، به تیمارهای مشخص شهده، اضهافه گردیهد. بهرای مشهاهدهی نمونهها، از میکروسکوپ نوری با دوربین دیجیتال استفاده شد .برای اعمال فراصوت، دستگاه فراصهوت پهروب بها تهوان پهایین انتخاب شد. به جهت سهولت کار و به حداقل رساندن احتمهالآلودگی ثانویه ،محیط کشت در درون لولهی آزمایش تهیه شد .آزمایش با انتقال 2% کشت آغازگر به لولهها، آغهاز شهد. بهرای کاهش احتمال مرگ و میر مخمر در اثر افزایش دمای ناگهانی ناشی از اعمال فراصوت، کنترل شرایط دمایی و کهاهش دمهاینمونه طی اعمال فراصوت ،با استفاده از حمام یخ انجام شهده و دما در حدود درجه حرارت محیط تثبیت گردید) 15(. پهروب ، در عمق یک سانتیمتری محیط کشهت، درون لولهه قهرار داده ش د. ی ک نمون ه ب ه عن وان ش اهد و ش انزده تیم ار )تتی ین فرمو سیون با روش سطح پاسخ(، تهیهه و تیمهار فراصهوت بهافرکانس 24 کیلوهرتز، با توجه به توان فراصوت، زمهان اعمهالفراصوت و افزودن گلوکز اعمال شد. به جهت اینکه سلولههایاولی هی مخم ر، تح ت فراص وت ق رار گرف ت و ب رای اینک ه سلولهای حاصل از رشد نیز تحت فراصوت قهرار بگیرنهد و بههمنظور مشاهدهی نتیجه نهایی ،هر سه ساعت یکبار به صورت مداوم تها پایهان آزمهایش، اعمهال فراصهوت انجهام و تغییهرات ، مشاهده و ثبت شدند. کلیهی آزمونها سه بار تکرار شدند. دما و pH مایع به صورت متناوب اندازهگیری شهد ند )16(. آزمهون تتیین وزن خشک، به جهت بررسی بقای مخمر بتد از اعمهالفراصوت و همچنین بهرای بررسهی اثهر متغیر ههای فراصهوت ومیزان گلوکز محیط بر رشد مخمر و تشهکیل تهودهی زیسهتی ، انجام شد )17(. در مرحلهی قبل از اعمهال فراصهوت و بتهد ازتیمار با فراصوت، وزن خشک نمونهها، اندازهگیری شد. میهزانافزایش وزن خشک، نشاندهندهی رشد مخمر و بقای آن، طی اعمال فراصوت میباشد .برای این منظور، ابتدا حجم مشخصی از مح یط ب را PDB ح اوی میکروارگانیس م تخمی ر ش ده، برداشته و به ظهرف ههای سهانتریفوژ منتقهل و سهه بهار عمهلسانتریفیوژ نمونهها با سرعت 4000 دور در دقیقه، به مهدت 5 دقیقه انجام شد. سوپرناتانت فوقانی، جدا و پروتئین تکیاختههتوسط افزودن آب مقطر ،سه بار شستشو گردید. سه س بهرای رسههوبدادن مجههدد، در همههان شههرایط، سههانتریفوژ گردیههد. پروتئین تکیاخته به ظرفهای شیشهای که از قبل وزن شهده بودنههد، منتقههل شههده و در نهایههت، در دمههای 100 درجهههی سانتیگراد در داخل آون قرار داده شده تا به وزن ثابت برسند .
برای این منظور ،توزین نمونهها ههر 2 الهی 3 سهاعت یهکبهارانجام شد تا زمانی که وزن نمونهها در اثر حرارت و دمها تغییهرنکرده و ثابت بماند. تفاوت وزن اولیه و نهایی، میهزان پهروتئین تکیاخته را تتیین نمود) 18(. برای بهینهسازی اثهر فاکتورههابر افزایش راندمان رشد سهلولی ، از طهر آمهاری روش سهطحپاسهخ )Response surface methodology( اسهتفاده شهد )19(. در این تحقیق از طر باکس- بنکن )Box-Behnken( ب ا 16 آزم ایش ک ه ش امل 4 آزم ایش در نقط هی مرک زی )central point( اسههت، اسههتفاده گردیههد )20(. تغییههرات غیرقابل توجیه در پاسخ مشاهده شده ناشی از عوامل خهارجی،به وسیلهی تصادفی کردن ترتیب آزمایشها، کاهش داده شهد )21،22(. متغیرهای مستقل طر در سه سهطح ) 1- ، 0 ، 1+( شامل تهوان فراصهوت) X1,W( در سهطو ) 2 ، 6 و 10 وات( ،زمان اعمهال فراصهوت) X2,Sec.( در سهطو ) 10 ، 20 و 30 ثانیه( و افزودن گلوکز به عنهوان منبهع قنهد) X3,%w/w( در سطو) 5 ، 10 و 15 درصد( مهی باشهند. متغیهر وابسهته) Y( میزان وزن خشک )میلیگرم( انتخاب شد )جدول1(.

جدول 1. متغيرهای اصلي در سه سطح جهت تعيين ميزان پاسخ.

-6095-690121
+

0

1

10

6

2

1

+

0

1



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید