پژوهنده )مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي(
تاريخ دريافت مقاله: 31/33/3192 سال نوزدهم، شماره 5آذر، و پي دی در 93پي 030 01، صفحات 535 تا 543 تاريخ پذيرش مقاله: 23/8/3191
بررسي تأثير pH و درجه حرارت محيط بر نشانگرهای ويرولانس گونههای يرسينيا
دکتر محمد مهدی سلطان دلال0,5، سونيا سيد اميری0، دکتر محمدکاظم شريفي يزدی*3,4

3. مركز تحقيقات ميكروبيولوژي مواد غذايي، دانشگاه علوم پزشكي تهران، تهران، ايران
2. بخش ميكروبشناسي، گروه پاتوبيولوژي، دانشكده بهداشت، دانشگاه علوم پزشكي تهران، تهران، ايران
1. مركز تحقيقات زئونوز )بيماريهاي مشترك بين انسان و حيوان(، دانشگاه علوم پزشكي تهران، تهران، ايران
-10921207611

4. گروه علوم آزمايشگاهي، دانشكده پيراپزشكي، دانشگاه علوم پزشكي تهران، تهران، ايران چکيده
سابقه و هدف: يرسينيا انتروكليتيكا يك باكتري گرم منفي است كه سويههايي از آن در ايجاد اسهها در انسهان دليهس هسهتند. بهاتوجه به نقش نشانگرهاي ويرولانس در بيماريزايي و عدم اطلاع كافي در لصوص تأثير فاكتورهاي محيطي ماننهدpH و دمها بهر ايه ن نشانگرها در گونههاي يرسينيا، اين مطالعه با هدف تعيين اثر pH و دما بر نشانگرهاي ويرولانس يرسينيا انجام شده است.
مواد و روشها: اين مطالعه از نوع تجربي و در طي دو مرحله روي 32 سويهي ويرولان و 7 سويهي غيرويرولان يرسه ينيا از گونهه هها ي انتروكليتيكا، اينترمديا، كريستنسني و فردريكسني كه از منابع مختلف جدا شده بودند، انجام شد. در مرحلهي او مطالعه، تأثير pH و دما بر رشد باكتري و در مرحلهي دوم، تأثير pH و دما بر ماركرهاي ويرولانس با استفاده از تسهت هها ي اتواگلوتيناسه يون، وابسهتگ ي بههكلسيم، كريستا ويوله، استفاده ازساليسين- اسكولين، تهاجم سلولي 2-Hep و 1640-RPMI بررسي شد.
يافتهها: pH و دما، هر يك به طور مستقس، بر ميزان رشد باكتريها مؤثر بودند، درحهال ي كهه تهأثير متقهابل ي بهر يكهد يگر نداشهتند. در ضمن ،ويرولان و غير ويرولان بودن سويه، بر ميزان رشد مؤثر بود. نتايج نشان داد كه دمها بهر ويه رولانس مه ؤثر بهود ه درحهال يكهه pH، تأثيري بر كاهش ويرولانس در باكتري نداشهته اسهت. همچنهين ، 1 آزمهون كر يسهتا ويولهه ، 1640-RPMI و تههاجم سهلولي جههتنشاندادن لاصيت ويرولانس سويههاي يرسينيا، همخواني بيشتري داشتند. در ضمن، تعهداد ي از سهو يههها توانسهته بودنهد در تمهامي سطوح تيماري، ويرولانس لود را حفظ كنند كه اين مسأله ممكن است به علت پايداري پلاسميد ويرولانس اين سويهها باشد.
نتيجهگيری: نتايج بدست آمده نشان داد كه بر رشد باكتري، pH و دما، ولي بر ويرولانس باكتري، تنها دما تأثير دارد.
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

-18287234487

واژگان کليدی: یرسینیا انتروکلیتیکا، ویرولانس، pH، دما لطفاً به اين مقاله به صورت زير استناد نماييد:
Soltan Dallal MM, Seyed Amiri S, Sharifi Yazdi MK. The effect of pH and environmental temperature on the virulence
factors of Yersinia spp. Pejouhandeh :)5(91;4102235-243.
264264607

مقدمه0
يكي از معضهلاتي كهه ههماكنهون برلهي از كشهورها بها آندرگيرند، شيوع بيمهاري ههاي عفهوني نريهر اسهها بهه دليهساستفاده از مواد غذايي آلوده ميباشد. اين امهر هنگهامي اتفها ميافتد كه صنايع غذايي از نرهر بسهتهبنهدي و افهزودن مهوادنگهدارنده، بسيار پيشرفت كهرده اسهت. شهايد يكهي از دلايهس ظهور بيماريهايي نرير يرسينيوز )Yersiniosis( نيز، همهين

*نويسنده مسؤول مکاتبات: دکتر محمدکاظم شريفي يزدی؛ مركز تحقيقهاتبيماريهاي مشترك بين انسهان و حيهوان، دانشهگاه علهوم پزشهكي تههران ؛ تلفهن:
[email protected] :؛ پست الکترونيك)923( 88997949
علت باشد )3،2(. در جايي كه اين باكتري در كنار فلهور مهوادغذايي جايي براي ظههور نهدارد، اسهتفاده از رو ههايي نريهرسههرماگذاري، یليههايي كههردن مههواد غههذايي و افههزودن مههوادنگهدارنده باعث ميشود فلهور مهواد غهذايي از بهين رفتهه و در عوض، باكتريهاي سرمادوستي نرير يرسينيا، محيط را بهرايرشد و تكثير لود مناسب ببينند) 5-1(.
در مطالعهاي كه توسط Noble و همكارانش در سها هها ي 3982 تا 3985 در كانادا انجام گرفهت ، محققه ين در طه ي 42 ماه، 235 نمونهي مدفوع را جمهع آوري كهرده و بهه وسه يلهي تكنيك غنيسازي در سرما و كشهت ، آنهها را از لحها حضهور گونههاي يرسينيا مورد بررسي یرار دادند. از بهين نمونههههاي
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

212
جم عآوري ش ده، تع داد 312 م ورد از نر ر وج ود گون هي
يرسينيا، مثبت بودنهد كهه از ايه ن تعهداد ، 89 سهويهيرسه ينيا انتروكليتيكا، 42 سويه يرسينيا فردريكسني، 8 سويه يرسينيا اينترمديا و 2 سويه يرسينيا كريستنسني گزار گرديد )2(.
ويه رولانس )virulence(، به ه معنه اي شه دت درجه هي بيماريزايي در يك گونه از باكتري بوده و به عنوان نرخ مهر و مير و يا توانايي ارگانيسم براي حمله به بافتهاي ميزبان به هكار ميرود .ميكروارگانيسمهاي پاتوژن رودهاي، بها يكهي از دومكانيسم تهاجم و يه ا سهم زايهي )invasive and toxigenic( بيماري ايجاد ميكنند )7(. به ه طهور كلهي، یهدرت تههاجم بهه توانايي ارگانيسمهاي پاتوژن جهت نفهو در بافهتههاي بهدن، اطلا ميشود. البته بايد توجه داشت كه هر تهاجمي ،موجهببيماريزايي نشده و بيماريزايه ي نيهز فقهط از طريه تههاجم ، حاصس نميشود. تهاجم و بيماريزايي در بيشتر باكتريهها بهرپايهي وجود پذيرندههايي در سطح برلي از سلو هاي حيواني و سطح باكتريها بوده و اين ارگانيسمهاي بيماريزا، از طريه همين پذيرندهها به سطح سهلو ههاي ميزبهان متصهس شهده وبيماريزايي لود را نمايان ميسازند )8،9(. از طرفي، يرسه ينيا انتروكليتيكا یابليت توليد سم مقاوم به حرارت )heat-stable enterotoxin- ST( همانن د اشريشيا كلي دارد ك ه ب ه دو زيرگروه ST1 و STT2 تقسيم ميشود. بررسيهاي یبله ي مهانشان داده است كه اين سم یادر است در رودهي بچهه مهو ، گوانيلات سيكلاز را فعا نموده و موجب افزايش تجمع گوانين 1 و 5 مونوفسفات حلقوي شود )39(.
يرس ينيوز در انس ان عموم اًا در ارتبهاا ب ا بيمهاريه اي گاستروانتريت همانند انتريت است كه شايعترين علايم بهاليني آن شههامس تههب، دردهههاي شههكمي و اسههها اسههت )33(.
بيماريزايهي يرسهينيا انتروكلهيتيكها تحهت كنتهر دنهد ژنكروموزومي و پلاسميدي با سايز 44-42 مگادالتون است. با از دست رفتن پلاسميد، ويرولانس نيز از بهين مهيرود) 32،31(.
گونههاي مختلفي شامس انواع بيماريزا و غيربيماريزا، از مهوادغههذايي نريههر شههير لههام، آب آشههاميدني كلردهههي نشههده،سبزيهاي تازه و گوشت لام يا نيمپز و صدفههاي لهام جهداشده است )32-34(. لوك، به ه عنهوان مهمتهرين منبهع ايهنبهاكت هري در طبيع ت مط هرح اس ت و ب هه همي هن علههت، بيماريهاي نهاشي از ايهن ارگانيسهم را زئهونهوز )Zoonosis( ميدانند )39-37(.
Noble و همكارانش، نشهانگرهاي ويهرولانس شهامس رشهد وابسته به كلسيم، اتوآگلوتيناسيون، جذب كونگورد و اتصا به كريستا ويوله را بر اين گونههاي جداسازي شده بررسي كرده و نشان دادند كه تمامي 89 سويهي يرسينيا انتروكلهي تيكهاي جدا شده، نسبت به جذب كونگورد و واكنش اتوآگلوتيناسيون، مثبت، در حالي كهه تمهام سهويهههاييرسهينيا كريستنسهني جداسازي شده، نسبت بهه تمهام ماركرههاي ويهرولانس انجهامگرفته، منفي ميباشند )2(. همچنين در مطالعهاي كهه توسهط Prpic و همكارانش در سا 3985 در استراليا انجهام گرفهت ، تع داد 312 نمون ه ايزول ه يرس ينيا ش امس 332 ع دد س و يرسينيا انتروكليتيكا، 32 عدد سو يرسينيا فردريكسهن ي، 8
ع دد س و يرسينيا اينترمديا و 5 ع دد س و يرسينيا كريستنسني، از لحا حضور فاكتورهاي ويرولانس مانند جذب كونگ و رد، اتوآگلوتيناس يون و وابسههتگي ب ه كلس يم، م ورد آزمايش یرار گرفتند )29(.
با توجه به مهمترين راه انتقا يرسينيا كهه از طريه مهوادغذايي ميباشد و اينكه ويهرولانس يرسهينيا تحهت فاكتورههايمحيطي یرار دارد )34،53،23( و نرر بهه اهميهت فاكتورههايمحيطي در بروز برلي لصوصهات بيمهاريزايهي ميكهروبهها،
هههدف از انجههام ايههن مطالعههه، تعيههين تههأثير pH و دمهها بههر نش انگرهاي وي رولانس در بيم اريزاي ي گون هه اي مختل ف يرسينيا بوده است.

مواد و روشها
مطالعهي حاضر ،از نوع تجربي بوده و طه ي دو مرحلهه ، روي
39 سويهي يرسينيا از گونههاي انتروكليتيكا )34(، اينترمهد يا
)2(، كريستنسني )2( و فردريكسني )3( كه از منهابع مختلهفمانند شير لام ايران 1 نمونه )8/35%(، مدفوع ايه ران 1 نمونهه )8/35%(، سبزيهاي ايران 2 نمونه )5/39%(، مدفوع فرانسه 5 نمونه )1/22%( و آب فرانسه 2 نمونه )2/13%( جدا شده بودند، انجام شد .در مرحلهي او مطالعه، تهأثيرpH و دمها بهر رشهدباكتري و در مرحلهه ي دوم، تهأثيرpH و دمها بهر نشهانگرهايويرولانس با استفاده از تستهاي اتواگلوتيناسيون، وابستگي به كلسيم، كريستا ويوله، استفاده ازساليسين- اسكولين، تهاجم سههلولي 2-Hep و 1640-RPMI بررسههي شههد. در كليهههي مراحس آزمايش، از بهاكتريE. coli جهدا شهده از انسهان، به ه عنوان شاهد استفاده گرديد.
تست کريستال ويوله. ابتهدا سهويهههايي كهه جههت تسهت وي رولانس در نر ر گرفت ه ش ده بودن د )س ويهه اي اولي ه و سويههاي تحت تيمار pH و دما(، در محهيطTSB بهه مهدت38 ساعت در دماي 25 درجهه سهانتيگهراد نگههداري شهدند.
سپس با استفاده از استاندارد مك فارلنهد و سهرم فيزيولهوژي، ریتي از بهاكتري بهه ميهزانcfu/ml 391 تهيهه و مقهدار 3/9 ميليليتر از سوسپانسهيون فهو ، روي محهيطBHIA پخهشگرديد. براي هر سويه، دو پليت در نرر گرفته شد كه يكهي دردماي 17 و ديگري در دماي 25 درجه سهانتي گهراد نگههداريشدند. كلنيهاي بنفش، مثبت و كلنيهاي بدون رنه ، منفهيدر نرر گرفته ميشدند )22(.
تست 1640-RPMI آگار. ابتدا سهو هها در محهيطTSB همانند شرايط فو ، آماده و در دماي 25 درجهه سهانتيگهراد ، نگهداري شدند. سپس 3/9 ميليليتر از سوسپانسيون فو ، بههكمك آنس استريس، روي محيط 1640-RPMI آگهار وTSA پخ ش ش ده و س پس پلي ته ا در دم اي 25 ي ا 17 درج ه سانتيگراد به مهدت 48 سهاعت ، نگههداري شهدند . در محهيطTSA كه به عنوان شهاهد بهه كهار رفهت، تمهامي سهويه ههايويرولان و غير ويرولان، كلنيهايي به يهك انهدازه )mm 1-2( توليد ميكنند. در حهالي كهه در محهيط 1640-RPMI آگهار ، سويههههاي ويهرولان، كلنيههاي نهوك سهوزني و سهويهههايغير ويرولان، كلنيهاي بزر )تقريباتقريباً ههم انهدازه ي كلنهي ههايشكس گرفته در محيط TSA( تشكيس ميدهند )21(.
تست وابستگي به کلسيم. همانند رو فو ، سهو هها درمحيط TSB آماده و در دماي 25 درجه سانتيگراد نگههداريشدند. سپس 3/9 ميليليتر از سوسپانسيون فو ، روي محهيطBHI آگار و BHIO آگاروز به صهورت سهطحي كشهت داده وسپس پليتها در دماي 17 درجهه سهانتيگهراد بهه مهدت 24 ساعت، نگهداري شدند. سويههاي ويرولان، در دماي 17 درجه سانتيگراد و در حضهور منيهزيم، به ه علهت داشهتن پلاسهميدويرولانس، در محيط فاید كلسيم )محيط BHIO(، كلنيههاينوك سوزني تشكيس ميدهند. اين در حالي اسهت كهه همهينسويهها در همان دما ولي روي محيط BHIA، به علهت وجهودكلسيم، كلنيها بزر تشكيس ميدهند. همچنين، سهويه ههايغيهر وي رولان ، روي دو مح يط BHIA و BHIO، كلن يه اي بزر و مشابه تشكيس ميدهنهد كهه ناشهي از عهدم وابسهتگيرشد سلو هاي غير ويرولان به كلسيم ميباشد )24(.
تست اتوآگلوتيناسيون. ابتهدا سهويههها ي مهورد نرهر ، روي محيط TSA به طور مستقيم كشت داده شده و به مدت 2 تها1 روز در دماي 22 درجه سانتيگهراد و يهك لولهه ي ديگهر دردماي 17 درجه سانتيگراد بهه مهدت 38 سهاعت نگههداري و سپس سويههها از نرهر اتوآگلوتيناسهيون، مهورد بررسهي یهرارگرفتند. در لولههاي مثبت، مايع رويي كاملاً شفاف اسهت ولهي در انتهاي لوله یطعات دلمه )فولكوله( وجود دارد كه حتهي بهاتكان دادن، در محيط حس نميشوند. اما در لولهه ههاي منفهي، مايع رويي كدر بوده و ظهاهر دلمهه وجهود نهدارد. سهويهههاي
217
ويهههرولانس فقهههط در دمهههاي 17 درجهههه سهههانتي گهههراد ،اتوآگلوتيناسيون دارند و در دماي 22 درجه سانتيگراد ،دنين رويدادي ديده نميشود. در ضمن، سويههاي غير ويهرولان ، در هيچيك از دو دما، اتوآگلوتيناسيون نميدهند )25(.
تست ساليسين و اسکولين. سويهههاي مهورد آزمهايش، به ه صورت سهطح ي و عمقهي توسهط آنهس سهوزني ، روي محهيطاسكولين آگار كشت داده مهي شهوند. همچنهين، سهويه هها بههمحيط ساليسهين اضهافه شهده و سهپس در دمهاي 25 درجههسانتيگراد به مدت 24 ساعت نگهداري ميشهوند. سهويهههايويرولان معمولامعمولاً ساليسين و اسكولين منفي هستند. يعني هيچ تغيير رنگي روي محيط مذكور ديهده نمهيشهود، درحهاليكههسويههاي غير ويرولان، عموماعموماً مثبت بوده و محيط ساليسين را بعد از سپري شدن مدت انكوباسيون، به رن زرد در ميآورند .همچنين، با استفاده از اسكولين روي محهيط اسهكولين آگهار، باع ث آزاد ش دن آه ن موج ود در مح يط و ايجهاد رس وبسياهرن ميشوند )22(.
کشت سلولي 2-Hep. اين رو بهراي بررسهي تمهای بهينسلو هاي 2-Hep و باكتريها و همچنين به حهدایس رسهاندنباكتريهاي لارج سلولي آزمايش، طهي دو مرحلهه ي متهوالي ، انجام گرديد.
الف( مرحلهي عفوني نمودن سلو هاي 2-Hep. ابتهدا محهيطكش ت س لو ه اي 2-Hep موج ود در لول هه اي درپ يچدار
)leighthon tube( را كه یبلاًیبلا تهيه شده بودند، لالي كهرده وسلو ها با 5/3 ميلهي ليتهر Earle’s salt گهرم ، شستشهو دادهشدند .پس از دنهد دیيقهه، آن را لهالي نمهوده و بهه آن 5/3 ميليليتر محيط مخصوص اين مرحله) Infection medium( كه در وایع همان MEM بدون آنتهي بيوتيهك حهاوي بهاكتري است، اضافه گرديد. سپس لولههها بهه طهور افقهي بهه مهدت 1 ساعت در اتوكلاو 17 درجه سانتيگراد یرار داده شدند .به ايهنترتيب در طو 1 ساعت، باكتريههاي مههاجم، بها اسهتفاده ازیدرت تهاجمي لود، وارد سلو ها ميشوند. پهس از 2 سهاعت ، محيط كشت سلولي كه در اثر رشد باكتريها، زرد رنه شهده)تغيير pH محيط(، دور ريخته و سلو ها دندين بار) 5 يها 2 بار( با Earle’s salt گرم، به آرامي شستشو داده شدند.
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

ب( مرحله رشد داللي سلولي. پس از شستشهوي سهلو ههاي2-Hep ب ا Earle’s salt، ي ك ب ار ديگ ر س لو ه ا ب ا 5/3 ميليليتر محهيط مخصهوص مرحلههي 2 يعنهي محهيط رشهدداللي سلو گرم، شستشو داده شده و پهس از اضهافه كهردن 5/3 ميليليتر از محيط فو به سلو هاي 2-Hep، لولههها بههمدت 4 ساعت در دماي 17 درجهي سانتيگراد به ه طهور افقهي
218
یرار داده شدند. در طو اين مدت، باكتريهاي مهاجم كهه درمرحلهي او وارد سلو هاي 2-Hep شده بودند، به طور دالس سلولي شروع به تكثير نموده و فضاي سلولي را پهر مهي كننهد .
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

بهتر است هر يك ساعت، تغيير رن محيط كه نشهانه ي رشهدباكتريهاي لارج سلولي است، كنتر و در صورت تغيير رن محيط، مجدداً سلو ها سه مرتبه با 5/3 ميلهي ليتهرEarle’s salt گرم شستشو داده شده و پس از آن ،5/3 ميليليتر محيط رشد دالس سلولي، به سلو هه ا اضهافه گهردد. پهس از سهپريشدن 4 ساعت، محيط كشت سلولي دور ريخته شد و سلو ها سه بار با Dublecco’s PBS گرم به آرامي شسهته و بهه ايهنترتيب، لامس حاوي سلو ههاي 2-Hep آمهاده ي رنه آميهزيشدند )27(.
بررسي ميکروسککوپي لام هکای تهيکه شکده. لامهها بهابزر نمايي 3999، زير ميكروسكپ بررسي شدند. دنانچهه در سلو ههاي 2-Hep در 29 الهي 19 ميهدان ديهد، بهيش از 39 بههاكتري در هههر ميههدان مشههاهده شههده گههردد، يرسههينيا انتروكليتيكا مثبت در نرر گرفته ميشود.

يافتهها
اين مطالعه طي دو مرحله انجام گرفته است. مرحلهه ي او شامس تهأثيرpH و دماههاي مختلهف روي گونهه ههاي مختلهفيرسينيا بود. بيشترين ميهزان رشهد در 7=pH مشهاهده شهد.

جدول 0. بررسي ميزان پراکندگي گونههای ويرولانس يرسينيا برحسب نوع نمونه.

گونه يرسينيا
سويههای غير بومي ايران سويههای بومي ايران منبع جداسازی
Y.f Y.k Y.i Y.e Y.f Y.k Y.i Y.e – – – 1 – – – 1 مدفوع انسان
آب – – – – 3 3 3 – سبزيجات – – – – – – – –
شير

شير



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید