پژوهنده )مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي(
تاریخ دریافت مقاله: 2/3/3393
سال نوزدهم، شماره مرداد 3و ، پي در شهریور پي3 23999، صفحات 251 تا 261 تاریخ پذیرش مقاله: 31/5/3393
بررسي فعاليت ضد ميکروبي متابوليتهای سویههای پروبيوتيکي
Proteus بر سویههایي از Lactobacillus
ليلا گودرزی*2، دکتر روحا کسری کرمانشاهي1

3. كارشناس ارشد میکروبیولوژی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه الزهرا )س(، تهران
-10565208118

2. استاد میکروب شناسی ،گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه الزهرا )س(، تهران چکيده
سابقه و هدف: باكتریهای اسید لاكتیک، گروهی از باكتریهای گرم مثبت، بدون اسپوور، كپروی یپا میلپهای شپک و كاتپالاز من پی هستند كه عموماعموماً به عنوان ارگانیسمهای ایمن در نظر گرفته میشوند. گونپه هپا ی Proteus نیپ ز از اعضپا ی خپانواده ی انتروباكتریاسپه ، باكتریهای گرم من ی و متحركی هستند كه به عنوان عوام بیماریزای مهم مجاری ادراری و ایجادكننپده ی ع ونپت متاابپک كپاتترادراری مطرح میباشند. این مطالاه، با هدف تایین اثپر دپد میکروبپ ی مپا یع رویپی از كشپت سپویههپا ی مختلپ Lactobacillus از خانوادهی پروبیوتیکها علیه سویههای مختل Proteus، با انجام روشهای گوناگون و مقایسهی این روشها به منظور تایپی ن بهتپر ین خاصیت دد میکروبی، انجام گرفت.
مواد و روشها: كلیهی سویههای میکروبی مورد است اده، از مركز كلکسیون باكتریها و بارچهای سازمان پژوهشهای علمی و صناتی ایران و نیز انستیتو پاستور ایران، بپه صپورل لیپوفلیزه تهیپه شپد. روشهپای مپورد اسپت اده بپرای تشپخیا فاالیپت دپد میکروبپیLactobacillus rhamnosus ،Lactobacillus fermentum ،Lactobacillus plantarum ،Lactobacillus acidophilus و Lactobacillus casei در مقاب یکدیگر و نیز علیه سویههای پاتوژن، شام تسپت نقطپه گپااری )Agar spot(، روش چاهپک پلیپت
.بود MODA و متد )Well diffusion agar(
یافتهها: نتایج نشان داد سویههای Lactobacillus مورد بررسی با هر سه روش مورد بررسی، توانستند باعپ مهپار رشپد سپویههپایبیماریزای Proteus شوند.
نتيجهگيری: با توجه به سهولت كار، صرفهی ابتصادی و حساسیت بیشتر در روش كمپیMODA ، اسپت اده از ایپن روش نسپبت بپهسایر روشها، پیشنهاد میگردد.
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

-17931226887

واژگان کليدی: Proteus، سویههای Lactobacillus، بررسی فاالیت دد میکروبی لط اً به این مقاله به صورل زیر استناد نمایید:
Goudarzi L, Kasra-Kermanshahi R. Survey of some metabolites of Lactobacillus strains as probiotic on antimicrobial
activity against some Proteus strains with different methods. Pejouhandeh :)3(91;4102152‒160.
8645497

مقدمه2
پروبیوتیک) Probiotic( واژهای یونانی و بپه مانپای “بپرایزندگی” است كه نخسپتین بپار توسپ Lilly و Stillwell در س ا 3915 ب ه منظ ور تود ی م واد ترش حی توس ی ک میکروارگانیسم كه رشد یک میکروارگانیسم دیگپر را تحریپکم یكن د، اس ت اده ش د )3(. در س ا 2002، Ouwehand و همکپارانش پروبیوتیپکهپا را تحپت عنپوان “فپر آوردهه ایی از

*نویسنده مسؤول مکاتبات: ليلا گودرزی؛ گروه زیست شناسی، دانشکده علپومپایپپپپپه، دانشپپپپپگاه الزهپپپپپرا )س(، تهپپپپپران؛ پستتتتتت الکترونيتتتتت:
[email protected]
سلو های میکروبی یا اجزایی از سلو هپای میکروبپی كپه اثپر م یدی روی سلامت و آسایش انسان دارند”، تاری كردند. در این تاری ، پروبیوتیکها محدود به میکروبهای زنده نبپوده واشکا غیر زندهی آنها نیز روی سلامت انسان، تأثیر میگاارند
.)2(
سویههای باكتریهای اسید لاكتیک كه از باكتریهپای گپرممثبت، با اشکا كوكسی و یا رشپته ای و نیپز مقپاوم بپه اسپیدمیباشند، بپه عنوان میکروارگانیسمهای مامپو بهكپار رفتپپه به عنوان پروبیوتیک محسوب میشوند )3(. باكتریهای اسپیدلاكتیک، به خصوص جنسهای غیر بیماریزا و م ید آنها نظیر Streptococcus ،Leuconostoc ،Lactobacillus و Pediococcus، در صنایع غاایی، بپه فراوانپی مپورد اسپت ادهبپرار میگیرنپد. از میپ پان بپاكتپ پریهپ پای اسیپ پد لاكتیپ پک، Lactobacillus بپه دلیپ كاربرده ای بیوتکنولوژیپک ب القوهشناخته شده از آنها و همچنین اهمیت آنها در صنایع غپاایی،بیش از سایرین مورد مطالاه برار گرفتپه انپد )4(. در مطالاپالمختل ، اثر پروبیوتیکها در ممانات و درمان طی وسپیای ازبیماریهای رودهای، به اثبال رسیده است. این بپاكتری هپا ، بپاتولید محصولال ددباكتریایی )مانند باكتریوسینها، بوتیریپکاسید و متابولیتهای اكسیژن مث پراكسید هیدروژن(، تولیپداسیدهای چرب با زنجیرهی كوتپاه، تولیپد بیوسپورفاكتانتهپا،ربابت با باكتریهای بیماریزا برای اشغا گیرندههای سطحی و اكتساب مواد غاایی، تولیپد آنپزیمهپای مت پاول و تجزیپهی بهتپپر مپپواد غپپاایی، تحریپپک انتروسپپیتهپپا بپپرای تولیپپدسایتوكاینها، تنظیم و تحریک سیستم ایمنپی و اثپر بپر بیپانژنهای بیماریزا، میتوانند اثرال درمانی سود بخشپی د اشپتهباشند )5(. به علت تولیپد فاكتورهپای دپد میکروبپی متاپدد ، پروبیوتیکها به عنپوان عوامپ درمپانی و پیشپگیری كننپده از بیماریهای ع پونی ایجپاد شپده توسپ پپاتوژن هپای دهپانی ، رودهای و ادراری- تناسلی، مطرح شدهاند )1(.
از سپپپوی دیگپپپر ، گونپپپههپپپای Proteus، از خپپپانوادهی Entrobacteriacea، بزرگترین و نامتجانسترین مجموعهی باس ی ه ای گ رم من ی، ب ا اهمی ت ف و الا اده در پزش کی میباشند و شام ارگانیسمهایی هستند كه در همه جا حضپورداشپته و در تم ام جهپان در خ اس، آب و س بز یجال یافپپت میشوند. این میکروارگانیسپم هپا ، بپه عنپوان بسپمت ی از فلپورطبیای روده در بیشتر حیوانال و همچنپ ین انسپان ، محسپوبمیشوند. این باكتریها، عام بیماریهای مختل پ ی در انسپانبوده و 30 تا 35 درصد ك بپاكتر یمیهپا، بپیش از 00 درصپدع ونتهای مجاری ادراری و بسیاری از ع ونتهپا ی رودهای را به خود اختصاص دادهاند )0(. افرادی كه از ع ونتهای مجاری ادراری ناشپی از Proteus mirabilis و Proteus vulgaris رنج میبرند، اغلک دچار باكتریوری، سیستیک، سنگهای كلیه و مثانه، انسداد كاتتر، پیلون ریت مزمن و تک میشوند )8(.
چنپپدین روش بپپرای شناسپپایی فاالیپپت دپپد میکروبپپیLactobacillus در دسترس است كه بر اساس اثبال فاالیپت
آنتاگونیستی آنها، استوار مپی باشپد . مامپولاً ایپن روشهپا ، در محی جامد انجام پایرفته و بر اسپاس شناسپایی مهپار رشپدسویههای حساس علیه سویههای آزمپون ، صپورل مپیپپایرد.
س ادهت رین روش جه ت آزم ایش مح ی ب رای تولی د م واد ددمیکروبی، رشد باكتریهپای تولیپد شپده در آگپار پوشپیده
353
شده با لایهی دیگری از آگار است كه شام ارگانیسم حسپاس میباشپد. در ایپن روش كپه بپه آگپار اسپوال ماپروف اسپت، ارگانیسم مورد آزمایش در فرم نقطهای در پلیت آگار گااشپتهشده و باد از نگهداری كلنیهای نهایی، با لایپه ای از آگپار كپهشام ارگانیسم حسپاس اسپت، پوشپیده مپیشپود )9(. روش دیگر، انتشار از طریق چاهک) well diffusion( است كپه درس ط پلی ت، ارگانیس م حس اس كش ت داده م یش ود و در چاهکهای ایجاد شده بر سط محی، از محلو رویی محی كشت ارگانیسم مورد آزمپایش ، پوشپیده مپیشپود. در هپر دوروش انجپام شپده ب ر سپط محپی جام د، باپد از مرحل هی نگهداری اطراف ح ره و یا نقطه، ناحیهی بازدارنده، باب رویت اس ت. بن ابراین، ای ن بازدارن دگی، م واد د د میکروب ی روی ارگانیسم حساس را نشان میدهد )30(.
از روشهای دیگر كه روی محی كشت مایع انجام میپایرد و بر اساس كدورل محی ، وبتی رشد در حضپور غلظپتهپایمت اول مواد ددمیکروبی صورل میگیرد، مپی تپوان بپه روشپیشنهاد شده توس Lash و همکپارانش بپا عنپوانMODA اشاره نمود. این روش، بر پایهی اختلاف جپاب مشپاهده شپدهب ین نمون هی كنت ر و نمون هی آزم ون، ب ه عن وان فاالی ت د دمیکروبی ب وده و ب ه ص ورل كم ی و ب ا درص د، فاالی ت ددمیکروبی را مقایسه مینماید )33(.
بنابر آنچه گ ته شد، پژوهش حادر با هدف تایپین اثپر دپدمیکروبپ ی مپ ایع رویپ ی از كشپ ت سپ ویه هپ ای مختلپ Lactobacillus از خانوادهی پروبیوتیکهپا علیپه سپویههپایمختل Proteus با بهكارگیری روشهای مختل و مقایسهی این روشها در تایپین بهتپرین خاصپیت دپد میکروبپی بپودهاست.

مواد و روشها
كلیهی سویههای میکروبی مورد است اده، از مركز كلکسپ یون باكتریها و بارچهای سازمان پژوهش علمی و صناتی ایپ ران و نیز انستیتو پاستور ایران، به صورل لیپ وفیلیزه تهیپ ه شپد كپه
شام 5 سویهی Lactobacillus و چهپار سپویهی Proteus استاندارد با مشخصال زیر بودند:

Lactobacillus acidophilus ATCC 4351
Lactobacillus plantarum ATCC 8034
Lactobacillus fermentum ATCC 9338
Lactobacillus rhamnosus ATCC 0419
Lactobacillus casei ATCC 39392
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Proteus mirabilis ATCC 0002
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

354
Proteus mirabilis OXK ATCC 35341
Proteus vulgaris PTCC 3382
Proteus vulgaris ATCC 0829

کشت سویههای ميکروبي. محیطی كه در ایپ ن تحقیپ ق بپهعنوان محی كشت اصلی برای Lactobacillus مورد است اده برار گرفت، محپی كشپت (MRS (Man-Rogosa-Sharpe براث و MRS آگار بود. از این محی ، برای كشتهپا ی روزانپهLactobacillus است اده گردید. سویههای خریداری شده باد از احیا، به منظور كشت روزانه روی محی های فو ، در دمپا ی 30 درجهی سانتیگپراد در شپرا ی بپ یهپواز ی بپه مپدل 24 ساعت، گرماگااری شدند. سویههای بیماریزای مورد اسپت ادهنیز، روی محی های كشت نوترینت بپراث كشپت داده شپدند.
پس از گاشت زمان انکوباسیون و رشد باكتریها، از سویههای Proteus مورد بررسی، سوسوانسیون سلولی تهیه شد.
ارزیابي فعاليت ضد ميکروبي سویههای Lactobacillus. در ای ن مطالا ه، از روشهپای نقط هگ ااری )Agar spot(، چاه ک پلی ت )Well diffusion agar( و MODA ب رای تشپپخ یا فاالیپپ ت دپپد م یکروبپ ی سپپویه هپپای مختلپ Lactobacillus اعپم از L. plantarum ،L. acidophilus، L. rhamnosus ،L. fermentum و L. casei در مقابپپ یکدیگر و نیز علیه سویههای پاتوژن ذكر شده در این بررسپ ی، است اده گردید.
جداستتازی متتایی رویتتي از کشتتت ستتویههتتای Lactobacillus. در ارل نه ای 50 میل یلیت ری ،مق دار 30 میلیلیتر از محی كشت MRS براث استری ، آماده و به آنهپا3000 میکرولیتر از كشت شبانه سپو یههپا ی Lactobacillus مورد بررسی، جداگانه تلقی گردید. ارلنهای حپاو ی بپاكتر ی، در دمای 30 درجهی سانتیگراد و شرای بپ یهپواز ی بپا 2CO 5%، به مدل 24 ساعت انکوبه شدند. به منظور جداسازی مایع رویی كشت Lactobacillus، محتویال ارلنهپا بپه مپدل 20 دبیق ه در دم ای 4 درج هی س انتیگ راد و ب ا دور g 0000، سانتری وژ شدند. سوس، مایع رویی فیلتر شده) µm 22/0( به منظور ارزیابی خاصیت دپد م یکروبپ ی آنهپا عل یپ ه سپو یههپا ی مختل Proteus، با روشهای مختلپ ، مپورد سپنجش بپرارگرفتند) 32(.
روش نقطتتهگتتذاری Agar spot)). در ایپپن روش ،30 میکرولیتر از كشت شپبانه ی بپاكتر ی هپای بیمپار یزا، درون 0 میلیلیتر محی كشت BHI نیمه جامد )با 0/0 درصد آگپار( ، در دمای 40 درجهی سانتیگپراد ، ریختپه شپد. پپس از بسپتهشدن محی فو در پلیت، 5 میکرولیتر از مایع رویپی كشپتLactobacillus، در مركز پلیتها نقطهگااری شپدند. باپد ازگاشت 38 تا 24 ساعت، بررسی تولید هالهی عدم رشد توس مایع رویی كشت سویههای Lactobacillus علیه سپو یههپا ی مختل Proteus، ثبت گردید )9(.
روش انتشار در چاه پليت )Well diffusion agar(. طی این روش، از سوسوانسیون باكتریهای بیماریزای كشپتداده شده در محی نوترینت براث، كپدورت ی ماپاد 5/0 مپکفارلن د )CFU/ml 308×5/3( تهی ه ش د. س وس ب ا س وا ب استری ، از باكتری بیماریزا با كدورل 5/0 مپک فارلنپد، روی محی مولر هینتون آگار، كشت متپراكم و در سپه جهپت دادهشد. چاهکهایی به بطر 1 میلیمتر بر روی محپ ی مپاكور درفواص مشخا و مناسک، ایجپاد شپد . سپوس ، از مپا یع رویپی كشت باكتریهای اسید لاكتیک، به میزان 300 میکرولیتر، در چاهکها ریخته شد. به منظور انتشار بهتر مایع رویی از كشت س ویهه ای Lactobacillus، پلی ته ا ح دود 30 دبیق ه در یخچا 4 درجپه ی سپانتی گپراد ، سپرماگاار ی شپدند. سپوس، پلی ته ا را ب ه آرام ی ب ه انکوب اتور در دم ای مناس ک رش د Proteus منتق كرده و پس از 24 ساعت، بطر هالپه ی عپدمرشد مربپ وط بپه هپر سپویه، توسپ خپ كپش م یلپ یمتپر ی، اندازهگیری و ثبت گردید. به منظور كاهش خطپا ، هپر آزمپونسه بار تکرار شد )30(. در این روش، واحد فاالیت )Activity unit( مپا یع روی ی كشپت س و یههپا ی Lactobacillus علی ه باكتریهای بیماریزای مورد بررسی، به صپورل زیپر محاسپبهشد )33(:

كه در آن ،Activity unit )واحد فاالیت( بپه عنپوان فاالیپ ت مهاری )بر حسک 2ml/mm(؛ Lz، مساحت ناحیهی عدم رشپد)بر حسک 2mm(؛ Ls، مساحت هر چاهک) بر حسک 2mm( و V، حجم نمونهی ریخته شده در داخ هر چاهک) بپر حسپکml( میباشد.
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:07 +0330 on Wednesday January 10th 2018

روش MODA. به منظور بررسی كم ی خاصیت دد میکروبی مایع رویی كشت سویههای Lactobacillus در محی مپا یع، از روش Micoscale Optical Density Assay( MODA( اسپپت اده گردیپپد. در ایپپن روش، از میکروپلیپپت 91 خانپپهای است اده شد. داخ هر چاهک، 300 میکرولیتپر از سپو یههپا ی Proteus مپپورد بررسپپ ی )بپپا نسپپبت 3:30000 در محپپی نوترینت براث( ریخته و سوس 35 میکرولیتر از مپا یع رویپی از كشت سویههای Lactobacillus، به هر چاهک ادافه گردید. همچنین، در چاهکهای جداگانه، از محی كشت MRS براث )كه با كمک اسید كلریدریک 3 نرما و هیدروكسید سپد یم 3 نرما ، pH آن به pH مایع رویی كشپت سپویههپا ی مختلپ Lactobacillus رسانده شده بود(، بپه عنپوان شپاهد محپی كشت و از چاهک فابد عصاره و یپ ا محپ ی كشپت ، بپه عنپوانشاهد رشد، است اده گردید. به منظور كاهش خطا، هر آزمپون ، سه بار تکرار شد. سوس، میکروپلیتها در دمپا ی 30 درجپه ی سانتیگراد به مدل 24 ساعت انکوبه شدند. پس از پایان زمان انکوباسیون، جاب نوری نمونهی آنهپا ، بپا اسپت اده از دسپتگاهالایزا ریدر، در طو موج 100 نپانومتر، خوانپده شپد. اخپتلافجاب مشاهده شده بین چاهکهای كنتر )محپ ی كشپت( وچاهپپکهپپا ی آزمپپون )مپپا یع رویپپی كشپپت سپپو یههپپا ی Lactobacillus(، به عنوان فاالیت ددمیکروبی مایع رویی از كشت سویههای Lactobacillus علیه سپو یههپا ی بیمپار یزا، طبق رابطهی زیر گزارش گردید )34(:

جابمحی نوری كشت )چاهک كنتر( حاوی – روییجاب نوریكشت چاهک حاوی Lactobacillusمایع
300  )شاهد آزمون( Lactobacillus

= سلودرصد های اختلاف در باكتریاییرشد جاب نوری چاهک حاوی مایع رویی كشت
)شاهد آزمون(

یافتهها
نتتتایا ارزیتتابي فعاليتتت ضتتدميکروبي ستتویههتتای Lactobacillus عليه Proteus.
روش Agar spot. در بررس ی خاص یت د دمیکروبی م ایع رویی از كشت سپو یههپا ی Lactobacillus علیپ ه سپو یههپا ی Proteus مورد بررسی به روش آگار اسوال، هالهی عدم رشپدعلیه تمامی سویههای مورد بررسی، مشاهده گردید. بیشپتر ین هالهی عدم رشد در ایپ ن روش، مربپوط بپهLactobacillus 9338 fermentum ATCC علی ه Proteus mirabilis
35341 OXK ATCC بپپپا بطپپپر هالپپپه ی عپپپدم رشپپپد

355
00/300/22 و كمترین هالپه ی عپدم رشپد نیپ ز مربپوط بپه39392 Lactobacillus casei ATCC علیپه Proteus 0002 mirabilis ATCC بپا مقپدار 5/000/9 بپوده اسپت . همچنپپین نتپپایج، هپپیچ اثپپر آنتاگونیسپپتی از سپپویههپپای Lactobacillus مورد بررسی علیه یکدیگر را نشان ندادند.
روش چاهتت پليتتت . نتپپایج حاصپپ از بررسپپ ی فاالیپپت د دمیکروبی س ویهه ای Lactobacillus علی ه س ویهه ای Proteus با است اده از روش چاهک پلیت، در جدو 3 نشپانداده شده است. در این روش مشاهده شپد كپه میپ انگین بطپرهالپپه ی عپپدم رشپپد مپپایع رویپپی از كشپپت سپپویههپ ای Lactobacillus مورد بررسپ ی علیپ ه سپو یههپا ی Proteus از
00/33 ت ا 00/20 میل یمت ر، مت اول ب وده اس ت. از می ان پروبیوتیکهای مپورد بررسپی، Lactobacillus fermentum
9338 ATCC، بیش ترین بط ر هال هی ع دم رش د را علی ه سپویپههپا ی 0829 Proteus vulgaris ATCC و Proteus
35341 mirabilis OXK ATCC ب ه ت پرتیک بپرابپپر ب ا
00/300/20 و 00/300/39 داشته و كمترین بطپر هالپهی عپدم رشپد نیپز مربپوط بپهLactobacillus casei ATCC 39392 علی ه 3382 Proteus vulgaris PTCC براب ر ب ا 00/300/33 بپپود. هپپیچ اثپپر آنتاگونیسپپتی از سپپویههپپای Lactobacillus مورد بررسی علیه یکدیگر، دیده نشد.
محاس بهی واح د فعالي ت ض دميکروبي س ویهه ای Lactobacillus عليه Proteus. نتایج بررسی واحد فاالیپ ت م ایع روی ی از كش ت ب اكتریه ای Lactobacillus پ س از مشاهده و ثبت هالههای عدم رشد با اسپت اده از روش چاهپکپلیت )AWD(، در جدو 2 نشان داده شپده است. بپر اساس ای پن نت ایج ،9338 Lactobacillus fermentum ATCC بالاترین فاالیت مهاری بپ ه انپدازه ی 2ml/mm 10/2009، بپهواسطپهی ایجاد هالپ پهی عپدم رشپد 00/20 میلپ یمتپر علیپ ه 0829 Proteus vulgaris ATCC داشته است.
،Proteus mirabilis OXK ATCC 25256 ،Proteus mirabilis ATCC 2111 عليت ه Lactobacillus جدول 2. ارزیابي اثتر مایی رویي کشت ستو یههتا یمولتد متواد Lactobacillus بر حسب ميلت يمتتر و اثتر آنتاگونيست تي ستو یههتا ی Proteus vulgaris ATCC 2119 و Proteus vulgaris PTCC 2211 .ضدميکروبي عليه یکدیگر
-70103-247569مواد

مولد

سویه

میکروبی

دد

Lactobacillus

مواد

مولد



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید