پژوهنده )مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي(
تاريخ دريافت مقاله: 32/11/1293 سال نوزدهم، شماره 2خرداد، و پي تير در 91پي 9861 ، صفحات 99 تا 601 تاريخ پذيرش مقاله: 3/3/1292
تشخيص سيانوباکتریهای توليدکنندهی ميکروسيستين در تالاب انزلي با استفاده از روش PCR
سام مساحي*6، دکتر مژگان امتيازجو2، دکتر حسن شاهحسيني1,4

1. گروه بیولوژی آبزیان، دانشکده علوم و فنون دریایی ،واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران
3. دانشیار ،گروه بیولوژی آبزیان، دانشکده علوم و فنون دریایی ،واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران
2. دانشیار ،گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهر قدس ،تهران
-10921207612

4. مؤسسه پژوهشی ایرانیان ژن فناور، بزرگراه اشرفی اصفهانی، تهران چکيده
سابقه و هدف: شکوفایی سیانوباکتریها در آبهای سطحی منجر به تولید سیانوتوکسینهای خطرناکی مثل میکروسیستین م یش ود که مشکلات قابل توجهی ایجاد میکنند. در مطالع ه ی حاض ر، از ی ک آزم ونPCR بهین ه ش ده ب رای شناس ایی س یانوباکتریه ای تولیدکنندهی میکروسیستین موجود در تالاب انزلی استفاده شده است.
مواد و روشها: نمونهگیری آب از 02 ایستگاه واقع در نواحی شرقی، مرکزی و غربی تالاب انزلی صوور گرتو ا اخوتجرا DNA بوااختفاده از کی DNG-Plus انجام گرت ا آزمون PCR برای پرایمرهای جهانی خویانوباکتری هوا 23S30R و CYA106F( و پرایموراختصاصی ژن کُکدکنندهی میکروخیستین mcyA-Cd1F و mcyA-Cd1R( بهینه شده و حساخی و اختصاصی آن ارزیابی گردیوداخپس، آزمون PCR بهینه شده برای نمونههای تالاب انزلی به کار گرتته شدا ترایند کلونینگ محصولا PCR با توجه به رهنمودهای خازندهی کی انجام گرت .
يافتهها: مناسبترین دما برای مرحلهی انیلینگ، واکنش 65 درجه سانتیگراد بود. بیشترین میزان تکثیر DNA زمانی در غلظ ت 4/0 میکرومولار پرایمرها مشاهده شد. به کارگیری آزمون PCR بهینه شده روی نمونههای تالاب انزلی آشکار کرد که همهی ایس تگاه ه ای مورد مطالعه، آلوده به سیانوباکتری بودند که از بین آنها، سیانوباکتریهای تولید کنندهی میکروسیستین در 10 ایستگاه حضور داشتند .
محصولات PCR با موفقیت کلون شده و برای مطالعات آتی ذخیره گردید.
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

نتيجهگيری: ممکن است تالاب انزلی در معرض خطر غلبه سیانوباکتریها قرار گرفته باشد. از آزمون PCR بهینه شده در این مطالع همیتوان به عنوان یک ابزار کارآمد به منظور مونیتورینگ و کنترل سیانوباکتریها، به خصوص جهت شناسایی سویههای تولید کنن ده ی میکروسیستین در تالابها و یا سایر منابع آبی استفاده کرد.

-18287233961

واژگان کليدی: آب، ایران، خیانوباکتری، میکروخیستین، واکنش PCR لطفاً به این مقاله به صورت زیر استناد نمایید:
Massahi S, Emtyazjoo M, Shahhossieni H. Diagnosis of microcystin-producing cyanobacteria of Anzali Lagoon using an optimized PCR method. Pejouhandeh )2(91;4102:99‒106.
5084988

مقدمه6
س یانوباکتریه ا، جلب که ای س بز- آب ی پروک اریوتی فتوس نتزکنندهای هس تند ک ه در آبه ای گ رم، ش یرین و یوتروفیک )eutrophic( حضور دارند. شکوفایی سیانوباکتریها در آبه ای ب ومی ب ا تولی د س موم خطرن اکی موس وم ب ه

*نويسنده مسؤول مکاتبات: سام مسااحي؛ ش ماره 62، کوچ ه مین ا، خیاب اندربند، میدان قدس، تهران؛ تلف ن: 33832224 )031(، 09135282634؛ پسات
[email protected] :الکترونيك
سیانوتوکس ین، باع ا ایج اد مش کلاتی در مقی اس جه انیمیشود )1(. همچنین، بسیاری از این گونههای سیانوباکتریها در خورها، رودخانهها، دریاچههای آب ش یرین، اقی انوس ه ا وآبهای ذخیرهای و آشامیدنی، مشکلات قاب ل ت وجهی ایج ادمیکنند) 3(. بنابراین، برای حفاظت از مصرفکنن دگان آب ، از مسمومیت و در معرض قرار گرفتن سموم سیانوباکتریها، لازم است منابع آب از نظر حضور این سموم خطرناک به طور کمی و کیفی بررسی شده و از خطرات احتمالی ناشی مص رف آنه ا، پیشگیری شود.
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

100
میکروسیس تین )Microcystin( یک ی از مع روفت رین و شایعترین انواع سیانوتوکسینه ا م یباش د ک ه اغل ب توس گونههای مربوط به ج ن م یکروسیس ت ی )Microcystis(، آنابن ا) Anabaena( و پلانکت وتریک )Planktothrix( سیانوباکتریها تولید میش ود. ای ن س ، ی ک هپاپپتی د ت کحلق وی و غی ر ریب وزومی، محل ول و پای دار در آب و ح اوی چن د ین اس ید آمین هی غی ر رای ج م یباش د )2 و 4(. میکروسیستین توس ژن mcy کد شده و به واس طه ی آن ز ی میکروسیستین س نتتاز ) Microcystin synthetase( تولی د میگردد )6 و 5(.
امروزه، روشهای گوناگونی برای شناسایی سیانوباکتریه ای تولی د کنن دهی میکروسیس تین و افت راا ان واع مختل سیانوتوکسینها به کار گرفته میشود. از جمل ه ای ن روشه ا میتوان به ش امل الای زا )ELISA(، روش مم انعت ی پ روت ین فسفاتاز) PPIA(، شناسایی توکس ین ب ه روش ج ب در ف ازجامد) SPATT(، کروماتوگرافی مایع با کارایی ب الا ) HPLC( و کروم اتوگرافی م ایع- اس پکتروفتومتری جرم ی )LC/MS( اشاره کرد )9-8(. با این حال، هرکدام از این روشه ا، مزای ا و معایب خاص خود را دارند. به عنوان مثال، روش الایزا اغلب ب انتایج مثب ت ک اذب هم راه ب وده و ی ا روش HPLC مس تل زم ابزارهای فواالعاده گرانقیمت میباشد )9(. علاوه ب ر ای ن، ب هدلیل شباهت ژنتیکی نزدی ک ب ین س و یهه ای س یانوباکتری تولی دکنن ده و غی ر تولیدکنن دهی میکروسیس تین، امک ان شناس ایی س ویهه ای تولیدکنن ده براس اس معیاره ای مورفولوژیک وجود ندارد) 10(. اخیراًرا، پیشنهاد شده است که از روشهای مولکولی نظیر PCR میتوان به عنوان اب زار ی م ؤررجهت شناسایی سیانوباکتریها و ژنهای کُکدکنندهی توکس ین آنه ا به ره ب رد) 13-10(. ب ه عن وان مث ال، هیس برگوس و همکاران، با استفاده از PCR توانستند سویههای تولیدکنندهی میکروسیس تین مرب وط ب ه ج ن آنابن ا، میکروسیس تی و پلانکتوتریک را با ک ارا یی ب الاتر ی، شناس ایی نماین د )10(. علاوه بر این، آن ال یز ژنتیک ی س و یهه ای میکروسیس ت ی در نمونههای محیطی مشخص کرده است ک ه تع داد مع دودی از این میکروارگانیس ه ا، ژنه ای کدُکنن ده ی میکروسیس ت ین سنتتاز را دارا بوده و اغلب این س و یهه ا نی ز ب ه دل ی ل وق وعجهشهای ژنتیکی، توانایی تولی د میکروسیس ت ین را از دس تمیدهند )12 و 14(.
تالاب انزلی با مساحت 16 ه زار هکت ار در قس مت ش مالی بندر انزلی در استان گیلان واقع شده است و از جال ب ت ر ین و بزرگت رین زیس تگاهه ای طبیع ی ج انواران ای ران محس وب میشود. این تالاب از لحاظ اکولوژیک، تحت ت ثر یر بس یاری ازمیکروارگانیس ه ا از جمل ه س یانوباکتریه ای تولیدکنن ده یسیانوتوکسین قرار گرفت ه اس ت) 16(؛ ول ی ت اکنون ژن ه ایکُدکنندهی این سموم در این تالاب شناسایی و بررس ی نش دهاست. همانطور که پیشتر اشاره گردید، روش PCR به عنوان یک تکنیک کمککننده، جه ت شناس ایی س و یهه ای س م ی سیانوباکتریها و سموم آنه ا از جمل ه م یکروسیس ت ین مط ر ح میباشد. به همین دلیل در مطالعهی حاضر، ای ن اب زار جه تشناسایی ژن مسؤول تولی د میکروسیس ت ین در ت الاب انزل ی، بهکار گرفته شده است.

مواد و روشها
به منظور نمونهگی ری، 30 ایس تگاه در قس مت ه ای غرب ی، مرکزی و شرقی تالاب انتخاب گردید )شکل 1(. آب سطحی از هر ایستگاه در بطریهای دو لیتری پلاس ت یکی اس تر یل مج زابرداش ت و در جعب ه ح اوی ی خ-ژل ق رار داده ش د. س پ ، نمونهها در شرای دور از نور سریعاعاً به آزمایش گاه انتق ال داده شد. در آزمایشگاه، هر کدام از نمونهها در rpm 2000 به مدت 13 دقیقه سانتریفوژ گردید. سپ ، م ایع روی ی )س وپرناتانت(دور انداخته شد و پلت) pellet( حاصل با 600 میکرولیت ر آب ددِیونیزه )deionized water( مخلوط گردید.

a

b

a

b

شکل 6. تصوير ماهوارهای از ايستگاههای انتخاب شده برای نمونهگيری واقع در نواحي غربي )a(، مرکزی و شرقي )b( تالاب انزلي.

جدول 6. پرايمرهای مورد استفاده برای شناسايي سيانوباکتری و ژن کدکنندهی ميکروسيستين.

توالي پرايمر طول محصول PCR ژن
5′-GGGGAATYTTCCGCAATGGG-3′
5′-GACTACWGGGGTATCTAATCCCWTT-3′ 428 CYA359F CYA781R
5′-AAAAGTGTTTTATTAGCGGCTCAT-3′ 5’AAAATTAAAAGCCGTATCAAA-3′ 398 mcyA-Cd1R
mcyA-Cd1F
101
اس تخرا DNA ب ا اس تفاده از کی تDNG-Plus و طب رهنمودهای شرکت س ازنده انج ام گرف ت )ش رکت س یناژن، ایران(. ب ه ط ور خلاصه، μl 100 آب دیونیزه حاوی نمون ه ب ا400 میکرولیت ر از محل ول DNG در ی ک میکروتی وب 6/1 میکرولیتری مخلوط ش ده و رو ی heater block ب ه م دت 4 ساعت حرارت داده شد. سپ ، س انتر یفوژ در rpm 1300 ب هم دت 6 دقیق ه انج ام ش د، س وپرناتانت برداش ت و در ی ک میکروتیوب 6/1 میکرولیتری جدید با 600 میکرولیتر محل ولکلروفرم مخلوط گردید. پ از آن، مخلوط حاص له مج دداًدا ب اس رعت rpm 1300 ب ه م دت 10 دقیق ه، س انتریفوژ ش د و سوپرناتانت در میکروتی وب 6/1 میکرولیت ر ی جدی د ب ا 200میکرولیتر اتان ول س رد ، مخل وط گرد ی د. مخل وط حاص له درrpm 1300 به مدت 16 دقیقه سانتریفوژ و سپ دکانته شدهو با 600 میکرولیتر اتانول 80% مخلوط گردید. ب را ی ب ار دوم،سانتریفوژ در rpm 1300 به م دت 6 دقیق ه انج ام و دکانت هگردید. سپ ، جهت برطرف سازی الکل، میکروتی وبه ا روی heater block ح رارات داده ش ده و نمون ه ح او ی DNA، خش ک گردی د. در نهای ت، ب ا 100 میکرولیت ر آب دی ونیزه مخلوط شده و در دمای 56 درجه سانتیگراد به مدت 6 دقیقه انکوبه گردید )جدول 1(.

ب ا ب هک ارگیری DNA اس تاندارد س و یهی PCC7806 میکروسیس ت ی آئروژین وزآ )Microcystis aeroginosa( و پرایمرهای جهانی مورد استفاده برای شناسایی سیانوباکتریها )23S30R و CYA106F( و نی ز ب ا اس تفاده از پرایمره ای اختصاصی ژن کدکنن ده ی میکروسیس ت ین )mcyA-Cd1F و mcyA-Cd1R( واک نش PCR ب رای ه ر جف ت پرا یم ر بهینهسازی شد )جدول 1(. جه ت تع یی ت می زان حساس یت آزمون PCR بهینه ش ده، ای ن آزم ون رو ی س ر ی رق ت ه ای مختل حاوی می زان مشخص ی از DNA اس تاندارد س ویهی PCC7806 میکروسیستی آئروژینوزآ اعمال گردی د. جه تارزیابی اختصاصیت آزمون PCR بهینه شده ،پرایمرهای م ورداستفاده برای تکثیر DNA سیانوباکتری و ژن تولی د کنن دهی میکروسیستین و DNA گرفته شده از سایر موجودات از قبیل گون هه ای اس تافیلوکوکوس )Staphylococcus(، اس ترپتوکوکوس) Streptococcus(، ایک ولای )E.coli(،
،)Legionella pneumophila( لژی ونلا پنوم وفیلا
س وموموناس آئروژین وزا )Pseudomonas aeroginosa(، انسان و موش و DNA نمونههای کنترل مثبت و کنترل منفی مورد استفاده قرارگرفت.
واک نش PCR بهین هس ازی ش ده ب رای شناس ایی سیانوباکتریها و ژنهای تولیدکنندهی میکروسیستین موجود در نمونههای گرفته شده از تالاب انزلی، بهکار گرفت ه ش د. درگام بعدی، 10 میکرولیتر از ه ر محص ولPCR ب ه هم راه 3 میکرولیتر بافر لودینگ 6 ب ه چاه که ای ژل آگ اروز 6/1% حاوی رنگ سایبر گرین) CYBR Green dye( اضافه ش ده وبه مدت 46 دقیقه با ولتاژ 80 ولت، الکتروف ورز انج ام گردی د.
در نهایت، محصولات PCR روی ژل الکتروفورز ب ا اس تفاده ازتران لومیناتور ف رابنفش ) Ultraviolet transilluminator( رویت گردید.
جه ت خ الصس ازی، 60 میکرولیت ر از محص ول PCR در داخل یک لوله اپندورف با 6 میکرولیتر سدی استات 2 م ولارو 136 میکرولیتر الکل مطل س رد مخل وط ش ده و در فری زر منفی 30 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت انکوبه گردی د.
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

سپ ، نمونهها از فریزر خار شده و در rpm 1300 به م دت16 دقیقه سانتریفوژ گردید. پ از آن، دکانته شده و ب ا 300 میکرولیتر الکل 80% سرد مخلوط، ده بار وارونه ش ده و ب رای ب ار دوم در در rpm 1300 ب ه م دت 10 دقیق ه س انتریفوژ گردید. سپ ، مایع رویی دور ریخت ه ش د و پل ت حاص له دردمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 20 الی 40 دقیق ه انکوب هشد تا خشک گردد. در نهایت، محص ول ب اμl 30 آب مقط ر ، ذخیره گردید.
ع لاوه ب ر شناس ایی ژن کُدکنن دهی میکروسیس تین در نمون هه ای گرفت ه ش ده از ت الاب انزل ی، محص ولات PCR، خالصس از ی و ب ا اس تفاده از پلازمی د pTZ57R )ش کل 3(، ب اکتری E.coli JM107 و کی ت T/Acloning )ش رکت فرمنتاز( طب رهنمودهای شرکت سازنده کیت کل ون گرد ی د.
کلونهای نوترکیب به صورت کلنیهای آبی/ سفید روی پلی تمشخص شدند. اگر insert به درستی در جایگاه کلونینگ ک ه
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

103
درون ژن Lac Z اس ت، در جه ت ص حیو وارد ش ده باش د،کلنیهای سفید رنگ روی پلیت ظ اهر م یش ود. اگ رinsert درون وکت ور پلاس میدی درس ت وارد نش ده باش د، در ار رتجزیهی X-Gal در مجاورت IPTG، کلنیهای آبی رنگ روی محی LB Agar + Amp رشد م ی کنن د. پ از کلون ی گ، چندین کلنی سفید، انتخاب و مجدداً داخل پلیته ای ح او ی LB+Amp کش ت داده ش دند. س پ ، از ب ین کلن یه ای حاصله، چند کلنی مناسب انتخاب و پلازمیدهای آنها ب ا روشجوشاندن استخرا گردید. به طور خلاص ه، داخ ل ی ک لول ه،یک کلنی مجزا در 60 میکرولیتر آب مقطر حل شده و ب ا 60 میکرولیتر روغن معدنی مخلوط گردید. س پ درپ وش لول ه، بسته و با پارافیل پوشانده شد. پ از آن، لول ه در داخ ل آبجوش به مدت 16 دقیقه حرارت داده شد و سپ ب ا س رعت rpm 1300به مدت 10 دقیق ه ، س انتر یفوژ گردی د. در ادام ه ، مایع زیرین روغن که حاوی پلازمی د ب ود، ب ه لول هی دیگ ر ی منتقل و با استفاده از PCR بهینه شده، حضور یا عدم حض ورDNA مورد نظر، بررسی گردید. پ از تثیید حض ور قطع هی DNA مورد نظر، کلنی مربوطه در پلیتهای کش ت ، تکثی ر و پلازمیدهای آنان به روش فواال کر استخرا و برای مطالع اتبعدی ذخیره گردید.

شکل 2. ساختار پلازمی دpTZ57R خری داری ش ده از ش رکت فرمنت از جه تکلونیگ.

يافتهها
بهینه نمودن پروفایل چرخهی حرارتی )thermal cycling profile( به روش گرادیانت )خصوصاً زمان و دمای انیلین گ( ، مطالعه و مشخص گردید ک ه فاص له ی دم ای ب ین 61 ت ا 51 درجه، مناسبترین دما برای مرحله انیلینگ واکنش 65 درجه سانتیگراد بود. برای بهین ه ک ردن مق دار پرایمره ا، واک نش غلظتهای بین 1/0 تا 1 میکروم ولار از پرایمره ا در واک نش،آزمایش شد که بیشترین میزان تکثیر DNA زمانی در غلظت4/0 میکرومولار مشاهده گردید. همچنین، بهترین غلظت برای
2MgCl، 6/1 می لیم ولار و ب را ی dNTPs، 6/0 میل یم ولار بدست آمد. در الکتروفورز محصول PCR، باندهای اختصاص ی حاصل از آمپلیکون پرایمرهای اختصاص ی س یانوباکتری 428 جفت باز ط ول و ب رای پرایمره ای اختصاص ی ژن ککُدکنن دهمیکروسیستین، 398 جفت باز طول داشتند )شکل 2(.

a

b



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید