پژوهنده )مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي(
تاريخ دريافت مقاله: 72/5/3197
سال هجدهم، شماره بهمن6 و، پي در اسفند پي 910699، صفحات 013 تا 019 تاريخ پذيرش مقاله: 7/33/3197
سنتز نانوذرهی نقره از نيترات نقره توسط عصارهی کشت مخمر
Rhodotorula sp. strain GM5

دکتر مراحم آشنگرف*1

3. استادیار میکروبیولوژی، گروه علوم زیستی و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم ،دانشگاه کردستان ،سنندج

چکيده
سابقه و هدف: فناوری نانو رویکردهای جدیدی برای مبارزه و جلوگیری از بیماریها از طریق استفاده از اتصال در مقیاس اتمی مواد میگشاید. در میان بهترین مواد با خاصیت ضد میکروبی، نانوذرهی نقره به عنوان یکی از پرکاربردترین نانوذرات در علوم پزشکی، دارویی و بهداشتی مورد استفاده قرار گرفته است. توسعهی روشهای زیستی تولید نانوذرات، به عنوان روشی سازگار با محیط زیست و ارزان، مطرح است. اگرچه اثرات سمم ی یم ون نقره برای اغلب میکروارگانیسمها گزارش شده ولی گونههای مختلفی از میکروارگانیسمها، از جمله سویهی بومی مخمری غربالگری شمده در ایم ن پژوهش، میتواند با احیای یون نقره به فرم عنصری آن در قالب نانوذرهی نقره، بر سمیت آن غلبه کند. همد از تحق یم ق حاضمر، اسمتفاده از تموانبالقوهی سویههای جدید مخمری به عنوان زیست واکنشگر، برای احیای زیستی نیترات نقره به نانوذرهی نقره بود.
مواد و روشها: 33 سویهی مخمری بر اساس مشاهدات میکروسکوپی، ماکروسکوپی و تستهای بیوشیمیایی تشخیصی، از خاکهما ی جمم آوری شده در حوالی معادن طلا، واق در شهرستان قروه از تواب استان کردستان، بر اساس تکنیک غنی سازی انتخابی، غربالگمر ی و جداسماز ی شمدند.
سوپرناتانتهای حاصل از سویههای مخمری جداسازی شده، به عنوان زیست واکنشگر، با محلول نیترات نقره با غلظت 5/7 میلم ی ممورر در شمیکر انکوباتوردار به مدت 84 ساعت گرماگذاری شدند و سویهی مخمری که قادر به سنتز نانوذرات نقره بود، شناسایی شد. نانوذرات نقره تولیدی، توسط
.بررسی شدند Particle size histogram و SEM ،XRD ،UV-visible آنالیزهای طیف سنجی
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

يافتهها: از بین سویههای مخمری غربالگری شده، تنها سویهی GM5 قادر به سنتز خمارج سملولی نمانوذرات نقمره بمود. سمویهی ممذکور از نظمرویژگیهای ریخت شناسی، بیوشیمیایی و همچنین مولکولی، شناسایی و در جنس Rhodotorula )با شمماره ی دسترسم ی KF543865 در بانمکاطلاعات ژنی NCBI( قرار داده شد. نتایج بم ه دسمت آممده از مشماهدات چشممی، اسمککتروفتومتر ی UV-visible و تصماو یر بمه دسمت آممده ازمیکروسکوپ الکترونی SEM، پراش اشعه ایکس )XRD( و آنالیز توزی اندازهی ذرات، ثابت کرد که سوپرناتانت کشت مخمری Rhodotorula sp.
strain GM5، قادر به احیای زیستی نیترات نقره به نانوذرات نقره به اشکال کروی با توزی نسبتاًنسبتا باریک اندازهی ذرات و متوسط اندازهی ذرات 84 نانومتر بود.
نتيجهگيری: سنتز خارج سلولی نانوذرات نقره، بدون نیاز به مراحل پیچیدهی استخراج، میتواند با استفاده از سوپرناتانت کشت سمویه ی مخممر ی GM5 به عنوان زیست واکنشگر زیستی ارزان و محافظ محیط زیست، جایگزین روشهای فیزیکوشیمیایی جهت تولید نانوذرات نقره، مطرح شمود.
با توجه به اطلاعات ما، تاکنون هیچ مطالعهای از تولید نانوذرات نقره در جنس مخمری Rhodotorula صورت نگرفته و در این پروژه برای نخستین بار، سنتز زیستی نانوذرات نقره در سویهی مخمری Rhodotorula sp. strain GM5 گزارش شد.

-18269204746

واژگان کليدی: نانوذرهی نقره، احیای زیستی، Rhodotorula sp. strain GM5 لطفاً به این مقاله به صورت زیر استناد نمایید:
Ashengroph M. Synthesis of silver nanoparticle from silver nitrate using culture extract of Rhodotorula sp. strain GM5.
Pejouhandeh 2014;18(6):310-319.
5265116

مقدمه1
نممانوذرات ،شممامل ذرات جامممد کلو یممدی بمما انممدازه ای در محدودهی 34 تا 344 نانومتر میباشند. این ذرات، مشتمل بمر

*نويسنده مسؤول مکاتباات : ماراحم آشانگرف؛ کردسمتان، سمنندج، بلموار
پاسداران، دانشگاه کردستان، صندوق پستی 834، کدپستی: 35325-44322، تلفن و نمابر: 4478311 )4423(؛ پست الکترونيك: [email protected]
موادی با سطوح خارجی بسیار زیاد و ناهمگونی کم ممی باشمندکه پدیدههای کوانتومی بروز میدهند. آنچه باعم ههمور علممفناوری نانو شده، نسبت باری سطح بمه حجمم ممیباشمد کمهموجب گردیده مواد در مقیاس نانو، شروع به تغییر رفتار کمردهو رفتار سطح بر رفتار تودهای غلبمه کنمد) 3 و 7(. در واقم دراین مقیاس، قوانین فیزیمک کلاسمیک از بمین رفتمه و قموانینفیزیک کوانتومی وارد صحنه میشوند. تقریباً وقتی به مقیماسنانو میرسیم خواص فیزیکوشیمیایی، نقطه ذوب و حتی رنگ ،کاملاً متحول میشود. افزایش نسمبت سمطح بمه حجمم باعم میشود که اتمهای واق در سمطح نسمبت بمه اتممهمای درونحجم ذرات، اثر بیشمتری روی خمواص فیزیکمی ذرات داشمتهباشند. همچنین، افمزایش نسمبت سمطح بمه حجمم عملاوه بمر افزایش واکنش پمذیری ذرات، فشمار سمطحی را تغییمر داده و باع میشود که فاصلهی بین اتمهای ذرات با کاهش انمداز هی ذره، کاهش یابد که همین امر اثرات متقابلی بر خواص نموری،مغناطیسی، الکترونیکی و ترمودینامیکی ماده خواهد داشت) 1 و 8(. در حال حاضر، گستردگی و تنوع کاربردهای فناوری نمانوبه حدی است که صنعت، کشاورزی، محیط زیست، بهداشت و درممان، علموم داروی ی، اقتصمماد، تغذی ه و بس یاری دیگممر از جنبههای زندگی بشر، تحت تأثیر شگر آن قرار گرفته است .
درسالهای اخیر، تلاشهای بسیار زیادی به منظور تولید نانو ذرات به دلیل خواص ویژهی نوری، شیمیایی، الکتریکی و فوتو الکتریکممی آنهمما صممورت گرفتممه اسممت. همممین امممر بیممانگر استفادههای گوناگون این مواد در عرصههای مختلمف همچمونزیست واکنشگرها، علموم پزشمکی، دارویمی و بهداشمت ی، علمومزیستی، اپتیک، دانش داروهای زیستی، مکانیک، مغنماطیس وانرژی است) 5(. نانوذرات نقره به واسطهی اهمیت زیم ادی کمهدر صنای پزشکی و در درممان و بهبمود بیممار یهما ی عفمون ی )باکتریایی، قارچی، ویروسی و انگلی(، گوارشم ی، بیممار یهما ی پوستی از جملمه جموشهما، انمواع جراحمات و سموختگیهما وهمچنین تهیهی محلولهای خوراکی و ضدعفونی کننمده هما ی دست و سطوح دارد، ساخت آن نیز بسیار حایز اهمیم ت اسمت)4 و 2(.
تولیممد فیزیکوشممیمیایی نممانو ذرات نقممره اغلممب متحمممل هزینههای بار، سختی مسیر فرآیند سنتز، راندمان تولید کم و آلودگیهای زیست محیطی بمار ممیباشمد . از هممین روی ، بماتوجه به کاربرد رو به رشد نانوذرات نقمره و نیم از روزافمزون بمهتوسعهی روشهایی برای ساخت ابمزار و وسمایلی کمه آلمودگی زیست محیطم ی نداشمته باشمند، بهتمرین روش بمرا ی تهیم هی نانوذرات نقره، استفاده از سیستمهای زیستی به عنوان زیست-واکنشگر است که علاوه بر تولید انبوه با صر هزینهی کمتمر ، به دور از خطرات زیست محیطم ی صمورت گرفتمه و نمانوذراتزیستی تولید شده از لحما توز یم انمداز هی ذرات و پایم داری، نسبت به سنتز فیزیکی و شیمیایی، یکنواختتر هستند) 4(.
اگرچه اثرات سمی یون نقره بمرا ی اغلمب م یکروارگانیسمم هما گزارش شده ولی گزارشهای متعمدد ی بمرا ی سمنتز نمانوذراتنقره توسمط گونمههمای مختلمف میکروارگانیسمم هما از جملمه133باکتریها، قارچهای رشتهای، اکتینومیستها و مخمرها وجموددارد )73-9(. با این حال در مورد سنتز زیستی نانودرات نقمرهبه وسیلهی سویههای مخمری، مطالعات نادری صمورت گرفتمهکه در این ارتبما تنهما ممیتموان بمه مطالعمهی Kowshik و همکارانش اشاره نمود) 77(. در مطالعهی صورت گرفته توسط Kowshik و همک ارانش در س ال 7441، از س ویهی مخم ر MKY3، برای سنتز خارج سلولی نانوذرات نقره از یک محلول نیتراتی به منظور دستیابی به نمانوذرات نقمره بما ابعماد 7 تما 5 ن انومتری، در دم ا و فش ار مح یط اس تفاده ش ده اس ت. درمطالعهی حاضر، توان بالقوهی سمو یههما ی بموم ی مخممر ی بمهعنوان زیسمت واکنشمگر در اح یم ای زیسمت ی نیتمرات نقمره بمهنانوذرهی نقره، مورد بررسی قرار گرفتمه و بمرای اولم ین بمار درسطح مجام ملی و بینالمللم ی، سمنتز خمارج نمانوذرات نقمرهتوسط یک سویهی بموم ی مخممر ی از جمنس Rhodotorulasp. گزارش میشود .

مواد و روشها
نمک نیتمرات نقمره بما خلموص بماری 99 درصمد از شمرکتسممیگما-آلممدریچ )Sigma-Aldrich, St. Louis, MO( خریداری شد. محلولهای استوک نیتمرات نقمره در آب دو بمارتقطیر استریل، حل شمده و پمس از فیلتراسمیون بمه وسمیلهی فیلترهممای سممرنگی 77/4 میکرونممی، در دمممای 8 درجممهی سانتیگراد در یخچال و به دور از نور نگهداری شمدند . گلموکز،پکتون و عصارهی مخمر مورد نیم از بمرا ی تهیم هی محم یطهما ی کشت YPD )گلوکز 34 گرم در لیتر، پکتون 74 گرم در لیتمر و عص ارهی مخم ر 74 گ رم در لیت ر( از ش رکت م رک )E.
Merck, Darmstadt, Germany( خریممداری گردیممد. در موارد لزوم، برای جامد کردن محیط کشمت ممذکور، بمه آن 7 درصد آگار اضافه میشمد. محمیط کشمت -Dichloran RoseBengal Chloramphenicol Agar حماو ی 5 گمرم در لیتمر پکتون ،34 گرم در لیتر گلوکز ،3 گمرم در لیتمر دی هیم دروژن پتاسیم فسفات ،5/4 گرم در لیتر سولفات منیزیم، 447/4 گرم در لیتر دی کلوران ،475/4 گرم در لیتر رزبنگال ،3/4 گرم در لیتر آنتی بیوتیک کلرامفنیکل و 35 گرم در لیتر آگمار بماpH برابر 4/5، از شرکت Quelab انگلستان، خریداری شمد. اغلمبمواد استفاده شمده در واکمنش زنجیم رهای پلیممر از، از شمرکت
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

سیناژن )Cinnagen Company, Iran( تهیه شدند. نمون هگی ری از خ اکه ای ح والی مع ادن ط لا، واق در شهرستان قروه از تواب استان کردستان، انجام شد. نمونههما ی خاک در هر هما ی اسمتر یل جمم آوری و پمس از انتقمال بمه
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

137
آزمایشگاه، تا هنگام استفاده، در دمما ی 8 درجمه سمانتیگمراد نگهداری شدند. از هر نمونه، 34 گرم به ارلمن هما ی حماو ی 94 میلیلیتر سرم فیزیولوژیم ک )5/4 گمرم در لیتمر نممک سمدیم کلراید( از محیط اضافه شد و سکس سری رقت تهیه شد. از هر رقت، 744 میکرولیتر در محیط کلرامفنیکل رزبنگال آگار کمهبه آنها غلظت مشخصی از نیترات نقره) 5/7 میلیمورر( پس از استریل کردن از طریق پاریههما ی غشما یی میلم یپمور بما قطمرسوراخ 77/4 میکرون افزوده شده بود، به روش کشمت چمنمی )Spread plate( با میلهی سرکج، کشمت داده و پلیمت هما بمه م دت 5 روز در انکوب اتور 74 درج ه س انتیگراد گرماگمذاری شدند. کلنیهای مخمری رشد یافته بر روی محیط، پس از رم گرفتن و مشاهده در زیر میکروسکوپ و اثبات این موضوع کمهمخمر هستند، به منظور خالصسمازی بمه محمیطهما ی YPD آگار حاوی 5/7 میلیممورر نیتمرات نقمره ، انتقمال داده شمدند.
مخمرهای جداسازی شده، به محیطهای اسلنت انتقال یافتند.
محیط مورد استفاده، همان محیط YPD است که بمه منظمورخالصسازی مخمر استفاده گردیده است. از هر محیط دو عدد اسلنت تهیه گردید .یک اسلنت به عنوان کشت مادر نگهمداریو از محیط دیگر به عنوان منبعی جهت آزمایشهای مربو به سنتز زیستی نانوذرات نقره استفاده شد.
برای بررسی توانایی سنتز خارج سلولی نانوذرات نقره توسمطسویههای مخمری جداسازی شده، یک لوپ از مخمرهای تمازهرشد یافتمه ) 78 سماعته( بمر روی محمیطYPD جاممد را بمهمحیط YPD مای) 74 میلیلیتر محیط کشت YPD مای در یک ارلن 344 میلیلیتری( تلقیح کرده و به ممدت 78 سماعتدر انکوب اتور ش یکردار ب ا دور rpm 744 و دم ای 74 درج ه سانتیگراد، گرماگذاری گردید. از این محیط به منظمور تلقمیحدر محممیطهممای کشممت اسممتفاده گردیممد. یممک درصممد از سوسکانسیونهای مخممر ی تهیم ه شمده را د ر ارلمن هما ی 754 میلیلیتری حاوی 54 میلیلیتر محیط کشمت ممای YPD در دمای 74 درجه سانتی گراد بر روی شیکر ممدور ) 744 دور در دقیقه(، به مدت 84 ساعت گرماگذاری شد. برای جمدا کمردنتممودهی زیسممتی مخمممری از محممیط کشممت مممای YPD، از سانتریفیوژ یخچمال ی بما دور  g5444 در دقیقمه در دمما ی 8 درجه سانتیگراد به مدت 34 دقیقه اسمتفاده گرد یم د. پمس ازسه بار شستشو با آب دو بار تقطیر استریل، 34 گرم از تموده ی زیستی مذکور در ارلنهای 754 میلم یلیتمر ی کمه حماوی 54 میلیلیتر آب دو بار تقطیر استریل بود، ریخته شد و بمه ممدت84 ساعت در شیکر انکوباتوردار در دمای 74 درجه سانتیگراد و دور شیکر 744 دور در دقیقمه قمرار داده شمد. پمس از طمی دورهی گرماگذاری، تودههما ی سملول ی مخممر ی بما اسمتفاده ازسانتریفیوژ جمدا شمده و از سموپرناتانتهما ی عمار ی از تمود هی زیستی مخمری جم آوری شمده بمه عنموان زیسمت واکنشمگربرای احیای زیستی نیترات نقره به نانوذرات نقره استفاده شمد.
برای این منظور، به فلاسکهای 754 میلم یلیتمر ی حماو ی 54 میلیلیتر از سوپرناتانت برداشت شده مخمری، محلول نیتمرات نقره )با غلظت نهایی 5/7 میلیمورر( اضافه شمده و بمه ممدت84 ساعت تحت شرایط دمما یی 74 درجمه سمانتیگمراد و دور شیکر 744 دور در دقیقه گرماگذاری شد. به طور همزممان ، از محلول نیترات نقره )بدون تلقیح سوپرناتانت کشمت مخممری( به عنوان محیط کنترل استفاده گردید. خصوصم یت نمانو ذراتنقرهی تشکیل شده در محلول واکنش زیسمت تبمد یلی، مموردآنالیزهای XRD ،UV و SEM قرار گرفت .
شناسایی سمو یهی مخممر ی GM5 بمر مبنمای ویژگم یهما ی ریختشناسی و بیوشیمیایی، بر اساس اسمتاندارد طبقمهبنمد ی Kurtzman and Fell )7444( انجممام شممد ) 71(. جهممت تشخیص مورفولوژی سلولی با میکروسکوپ نوری، رم مرطوب از کشت مای دو روزه در محیط کشت YPD تهیم ه و بررسم ی گردید. جهت انجام شناسایی جمذب قنمدها، از محم یطYNB ((yeast nitrogen base اسمتفاده گرد یم د. ایم ن محم یط کمهحاوی انواع نوترینتها، ویتامینها، فاکتورهما ی رشمد و عناصمرکمیاب میباشد، به صورت آماده از شرکت HIMDEIA هنمدخریداری شد. سمکس جهمت تأییم د جمنس سمویهی مخممر ی مممذکور از تعیممین تممراد ژنهممای S rRNA18 و ITS ((Internal Transcribed Spacers استفاده شمد. اسمتخراجDNA ژنممومی سممویهی GM5 بممه روش تخریممب بمما کمممک دانممههممای شیشمممهای )glass bead disruption( روی سوسکانسیون حاصمل از کشمت 78 سماعته مخممر در محمیط کشت YPD مای انجام شمد. در ایم ن روش، 34 میلم یلیتمر از محیط YPD تلقیح شده با سویهی مخممر ی را برداشمته و دردور  g 1444 بمه ممدت پمنج دقیقمه سمانتر یفیوژ مم یشمود.
سکس، تودهی زیستی مخمری رسوب داده شمده بمه وسمیلهی آب مقطممر اسممتر یل، کمماملاً شستشممو داده شممد. پممس از آن ،سوسکانسیون مخمری در دور  g 1444 به مدت پنج دقیقمه سانتریفیوژ شد و پس از تخلیم هی محلمو ل رویمی ، بمه تمودهی سلولی رسوب یافته، 844 میکرولیتر از بافر لیم ز کننمده 001)-mM Tris-HCl pH 8.0, 10% SDS, 2% Triton X(100, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl اضافه و ورتکمس
شد. سکس 844 میکرولیتر از محلول فنل-کلروفمرم -ایزوآمیم ل الکل )به ترتیب با نسبت های 75 و 78 و 3( و همچنم ین 844 میلیگرم از دانههای شیشهای با قطر 5/4 میلیلیتر اضافه شد .سکس به مدت 35 دقیقه به شدت هم زده شد )در این مرحلمهبرخورد شدید بین دانه های شیشه ای و سلولهما ی مخممر ی، باعمم تخریممب کامممل دیمموارهی سمملولی مممیشممود. حضممور دترجنتها ،فنمل و سمایر ممواد موجمود، باعم سسمت شمدن دیوارهی سلولی و حذ پروتئینهما و چربمیهما ی موجمود دردیواره میشود و بنمابرا ین زمینمه ی تخریم ب کاممل د یم واره بمااستفاده از دانههای شیشهای فراهم میشود(. پس از همم زدن ،نمونه به مدت پنج دقیقه با دور  g 37444 سانتریفیوژ شمد.
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

محلول رویی برداشته و به لولهی فالکون استریل دیگری انتقال داده ش د. ه م حج م محل ول روی ی برداش ته ش ده، محل ول کلروفرم-ایزوآمیل الکل )به نسبت 78 به 3( اضافه و سمکس بمااستفاده از ایزوپروپانول سرد DNAی استخراج شمده ، رسموبداده شد. نمونه، به مدت 5 دقیقه، با دور g37444 در دمما ی 8 درجه سانتیگمراد سمانتریفیوژ شم د. پمس از آن ، بمه منظمورحذ نمکهای اضافی و سما یر ناخالصم یهما،DNA ی رسموبیافته، با استفاده از اتانول 44 درصد شستشو داده شد. مخلو حاصله به مدت 34 دقیقه روی یخ قرار داده شد. پس از آن به مدت پنج دقیقه، با دور  g 37444 سانتریفیوژ شده و سکس

جدول 9. مواد و مقادير مورد نياز برای انجام واکنش PCR در سويهی GM5.
غلظت نهايي حجم لازم برای واکنش با حجم نهايي 03 ميکروليتر مواد
1 X 5 µl 10 X PCR بافر
800 µM 1 µl )40 mM( dNTP مخلو
2 mM 2 µl MgCl2 (50 mM)
0.5 µM 1 µl Forward پرایمر
0.5 µM 1 µl Reverse پرایمر
0.1 U 1 µl Taq polymerase (5U/µl)
20 µg/ml 2 µl DNA الگو
– اضافه نمودن تا حجم نهایی 54 میکرولیتر آب تزریقی

131
مای رویی به وسیله سمکلر خمار ج شمد. پمس از تبخیم ر کامملاتانول، به رسوب حاصل، 54 میکرولیتر بافر TE یم ا آب مقطمرتزریقی اضافه و تا زمان انجام فرآینمد PCR در فریم زر منهما ی 74 درجه سانتیگراد، نگهمدار ی شمد ) 78(. پمس از اسمتخراج
DNAی ژن ومی س ویهی مخم ری GM5، ب ا اس تفاده از دو پرایمر همگانی UL18 و UL28 که از آنهما بمرای شناسما یی و طبقهبندی انمواع یوکمار یوتهما اسمتفاده ممیشمود، تک یم ر ژن مربوطه انجمام پمذیرفت )75(. تموال ی نوکلئوتیم دی پرایمرهما ی مربوطه، در جدول 3 نشان داده شده است .

جدول 1. تواليهای نوکلئوتيدی پرايمرهای استفاده شده جهت تعيين جنس سويهی GM5.
Name Orientation sequence (5ʹ-3ʹ)
UL18 Forward- tgtacacaccgcccgtc
UL28 Reverse- atcgccagttctgcttac

واکنش PCR در حجم نهایی 54 میکرولیتر مخلو واکمنشانجام شد. مواد واکنش دهنده در این فرآیند PCR در جمدول 7 نشان داده شده است.

شرایط دمایی واکنش در این فرآینمد PCR عبمارت بودنمد از دمای واسرشت شدن اولیه، 95 درجه سانتیگمراد بمه ممدت 5 دقیقه، سکس 14 سیکل تکرار دمای واسرشت شدن 95 درجه س انتیگ راد ب ه م دت 14 ثانیمه، دم ای اتص ال 54 درج ه سانتیگراد به مدت 14 ثانیه، دمما ی طویم ل شمدن 27 درجمهسانتیگراد به مدت 7 دقیقه. بعد از اتمام ایم ن سم یکل، دمما ی طویل شدن نهایی 27 درجه سانتی گراد بمه ممدت 34 دقیقمه بود. پس از الکتروفمورز محصمول حاصمل ازPCR بمر روی ژل آگارز 5/3 درصد تحت شرایط بافری TAE و در ولتاژ 44، باند تک یری از روی ژل جدا شده و پس از خالصسازی به وسیلهی کی ت تخل یص PCR شمرکت Fermentase، جه ت تعی ین تراد ژنی )Sequencing( به شرکت فزاپژوه جهت ارسال بمهآزمایشگاه Macrogen در کشور کرهی جنوبی، ارسال گردید.
نانوذرات نقرهی تشیکل شده در محلول واکمنش ز یسمت ی، بمااستفاده از مشاهدات هاهری )تغییم ر رنمگ محلمول واکمنش(،آزمایشات اسککتروفتومتری UV-visible (Analytik Jena’s spectrophotometer SPECORD 210, Carel Zeiss (Technology, Germany، روش پراش پرتو ایکس X-ray )
Diffractometer, D8ADVANCE, Bruker,
بررسی توزی ذرات و میانگین انمدازه ی ذرات بما ،Germany) Particle size analyzer (Malvern اسمممتفاده از و همچنین Instruments Ltd., Mastersizer 2000, UK) 138
تصویر برداری بما م یکروسمکوپ الکترونم ی روبشم ی )-KYKY
EM3200, KYKY Technology Development Ltd.,
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

China( مورد بررسی قمرار گرفمت. در مرحلمهی اول، تشم یکل نمانوذرات بما مشماهدهی تغییم ر رنمگ محلمول واکمنش ح اوی سوپرناتانت کشت باکتری و محلمول نیتمرات نقمره ) 3AgNO( مشخص شد. به منظمور تع یمی ن طیم ف جمذب ی محلمول رو یمی حاصل از سانتریفیوژ، نمونهها با سرعت  g 5444 به ممدت 5 دقیقه در دمای 8 درجه سانتیگمراد ، سمانتر یفیوژ شمد. سمکس
آنالیزهای XRD ،Particle size analyzer و SEM با هد تأیید کریسمتال ی بمودن نمانو ذرات تشمیکل شمده و همچنمین بررسی شکل و اندازهی آنها انجام پذیرفت.

يافتهها
از بین 33 سویهی مخمری با قابلیت تحملپذیری نسبت بمهیون سمی نقره، تنها سوپرناتانت کشمت سمویهی GM5، جمداشده از معدن طلای قمروه، قمادر بمه احیم ای نیتمرات نقمره بمهنانوذرات نقره، در غلظت 5/7 میلی مورر بود که با ایجاد تغییر رنگ محلول واکنش از سفید به قهوهای شناسایی شد )شکل 3 قس مت AII(. میکروارگانیس مه ایی ک ه ب ه عن وان زیس ت واکنشگر، قادر به احیای زیسمت ی نیتمرات نقمره هسمتند، رنمگمحل ول نیت رات نق ره را ب ه ص ورت ارغ وانی، قه وهای، زرد و خاکستری تغییر میدهند که دلیل ایجاد رنمگ هما ی متفماوت،مکانیسمهای متفماوت در اح یم ای زیسمت ی یم ونهما ی نقمره بمهنانوذرات نقره است که منجر به تولید نانوذرات با ابعاد و اشکال متفاوت شده و در نهایت رنگهای مختلفی از نمانوذرات هماهرمیشود) 2(. آنالیز نمونهها با اسککتروفتومتری UV-vis، یم ک پیک جمذب ی مشمخص را در طمول مموج 815 نمانومتر ) پیم ک اختصاصی برای نمانوذرات نقمره( نشمان داد کمه بیم انگر وجمودنانوذرات نقره در محلول واکنش است )شکل 3- قسمت BII(. بر اساس مناب معتبر، بیشینهی پیک جذبی نانوذرات نقره، در طممول ممموج هممای 844 تمما 854 نممانومتر ممم یباشممد) 74(.

شکل 3. مشاهدات چشمی و طیف سنجی UV-visible جهت تأیید سنتز خارج سلولی نمانوذرات نقمره توسمط سمویهی مخممریA .GM5 :
سوپرناتانت مخمر GM5 در محلول نیترات نقره) 5/7 میلی مورر( در ابتدای واکنش) I( و 84 ساعت پمس از واکمنش احیمای زیسمتی) B .)II:
طیفهای UV-visible اسککتروفتومتری حاصل از سوپرناتانت مخمر GM5 در محلول نیترات نقره در ابتدای واکنش) I( و 84 ساعت پمس ازواکنش احیای زیستی) II(. در واکنشهای احیای زیستی مذکور از شرایط دمایی 74 درجه سانتیگراد و دور شیکر rpm 744 استفاده گردید.

133، به ترتیب، پیکهایی بما مقمادیر º ،84/8º ،14/7º4/48 و º4/22 را نشان داد که با نمونهی اسمتاندارد نانوکر یسمتال هما ی نقره کاملاً همخوانی دارد) 72(.
در ادام هی ای ن پ ژوهش، آن الیز XRD ب ه منظ ور اثب ات نانوکریستالهای فلزی نقره انجام گرفت. براساس یافتههای بمهدسم ت آمم ده کم ه در شم کل 7 نشم ان داده شم ده اسم ت ،نانوکریس تاله ای فل زی نق ره در س طوح 333، 744، 774 و
135

شکل 7. آنالیز پراش اشعه ایکس )XRD( نانو ذرات نقره سنتز شده توسط سویهی مخمری GM5.

میکروگرا همای حاصمل از تصماویر می کروسمکوپ الکترونم ی با توزیم نسمبتاًنسمبتا باریم ک انمداز هی ذرات 75 تما 375 نمانومتر وروبشی و Particle size analyzer نیز سنتز نانوذرات کمروی متوس ط ان دازهی ذرات 84 ن انومتر را نش ان داد )ش کل 1(.

1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

شکل 1. عکسهای تهیه شده از میکروسکوپ الکترونی (I) SEM و آنالیز توزی نانوذرات نقره (II) سنتز شده توسط سویهی مخمری GM5.

پس از قطعی شدن توانایی تولیم د نمانوذرات نقمره توسمویهی مخم ری GM5، شناس ایی س ویهی منتخ ب ب ا اس تفاده از روشه ای فنموتیکی و مولک ولی، ص ورت پ ذیرفت. سممویهی مخمری GM5 که براسماس آنالیزهمای هماهر ی و مشماهداتدستگاهی، قابلیت احیای زیستی نیترات نقره به نانوذرات نقره را دارا بود، انتخماب و بمر اسماس ویژگمیهمای ر یخمت شناسم ی تشخیصی متداول مخمرها، مورد شناسایی قرار گرفمت ) 71( و به طور موقت به عنوان .Rhodotorula sp تشخیص داده شد .ویژگیهای مورفولوژیک و کشتی ایمن سمویه، در شمکل 8 )I و II( نشان داده شده است. سویهی GM5، از نظر ماکروسکوپی،
134
دارای کلنممی بممه رنممگ قرمممز تمما صممورتی بمموده و از نظممرمیکروسکوپی به صورت تک سملول ی و فاقمد ریسمه بموده و بمهشکل کروی یا بیضویهای منفرد، دوتما یی و یم ا گروهم ی دیم ده میشوند و معمورً با جوانه زدن تک یر مم ییابنمد )شمکل II8(.
جهت شناسمایی دقیمق سمویهی GM5، ابتمداDNA ژنمومیاستخراج و سکس ژن کد کنندهی نواحی ITS و S rDNA18
I

I
II

II



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید