پژوهنده )مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي(
تاريخ دريافت مقاله: 72/6/3197
سال هجدهم، شماره 5آذر ، و پي دی در 94پي 531 9، صفحات 452 تا 422 تاريخ پذيرش مقاله: 71/31/3197
بررسي عملکرد سلولهای شبه عصبي حرکتي مشتق از بافت چربي موش صحرايي با استفاده از رنگآميزی کلسيم داخل سلولي و ارزيابي ترشح وزيکولهای سيناپسي
مرضيه درويشي3، دکتر تقي طريحي*4، دکتر عليرضا دلشاد1، دکتر عليرضا مصباح نمين2، دکتر طاهر طاهری 5

3. گروه علوم تشریح، ساختمان علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران
7. مرکز تحقیقات علوم و اعصاب شفا، بیمارستان خاتم الانبیا، تهران
1. گروه علوم تشریح، دانشگاه شاهد، تهران
گروه بیوشیمی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران
-10903208755

مرکز تحقیقات علوم و اعصاب شفا، بیمارستان خاتم الانبیا، تهران چکيده
سابقه و هدف: با وجود پیشرفتهای گسترده در زمینهی کشت سلولهای بنیادی، هنوز انتخاب بهترین منبع سلولی کارآمد جهتت تزر یت ق، قابت تأم است. علاوه بر این، تا کنون از نشانگر کلسیمی برای بررسی سلولهای عصبی حرکتی استفاده نشده است. روشهایی که تا کنون برای بررسی عملکرد سلولی مورد استفاده قرار گرفته همچون روشهای الکتروفیزیولوژی (patch-clamp)، علاوه بر سخت بودن و وقتگیر بودن، در هر بررسی فقط یک سلول را مورد بررسی قرار میدهد. در این تحقیق، نشانگر کلسیمی و ترشح وزیکولهای سیناپسی در سلولهای عصبی- حرکتی مشتق از بافت چربی، با استفاده از رنگآمیزی 43-FM1 و نشانگر کلسیمی 2-FLUO مورد بررسی قرار گرفته است.
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

مواد و روشها: از موش صحرایی نر بالغ، نژاد wistar با وزن 751-711 گرم استفاده شد. بافت چربی استخراج و سلولهای بنیادی آن جداگردید. سپس، سلولهای به دست آمده از لحاظ مارکرهای سلولهای بنیادی مزانشیمی و مولتیپوتنسی، مورد بررسی قترار گرفتنتد. ستلول هتا ی بنیت ادی مشتق از بافت چربی تحت تأثیر القا کنندههای رتینوئیک اسید و SHH، به سلولهای شبه عصبی حرکتی تمایز یافتند. بعتد از تمتایز، ستلول هتا ی تولید شده با استفاده از تکنیکهای ایمنوسیتوشیمی و RT-PCR مورد تأیید قرار گرفتند. در مرحلهی نهایی، فانکشنال بودن سلولهتا بتا توانتایی برقراری ارتباط عصبی-عضلانی، ترشح وزیکولهای سیناپسی و تبادلات کلسیمی، مورد ارزیابی قرار گرفت که برای این کار از روشهای همکشتت ی، رنگ آمیزی 43-FM1 و نشانگر کلسیمی 2-FLUO استفاده گردید.
يافتهها: سلولهای عصبی- حرکتی مشتق از بافت چربی، تمام مارکرهای مزانشیمی و اختصاصی چربی را بیان میکنند و توانایی تمتا یز بته ستایر ردههای سلولهای مزانشیمی شام سلول استخوانی، غضروفی و چربی را دارند. این سلولها، بعد از تمایز به ستلول عصتبی- حرکتت ی، مارکرهتا ی 1-oligo-2 ،islet و HB9 را بیان میکنند. همچنین، دارای توانایی برقراری ارتباط عصبی- عضتلانی ، ترشتح وز یکتول هتا ی سیناپست ی و تبتادلاتکلسیمی میباشند.
نتيجهگيری: نتایج بدست آمده نشان میدهد که سلولهای عصبی- حرکتی مشتق از بافت چربی، توانایی برقراری ارتباط عصبی- عضلانی، ترشتحوزیکولهای سیناپسی و تبادلات کلسیمی را داشته و یک سلول فانکشنال میباشند.

-18269213416

واژگان کليدی: سلول بنیادی مشتق از بافت چربی، سلول عصبی- حرکتی، رنگ آمیزی 43-FM1، نشانگر کلسیمی لطفاً به این مقاله به صورت زیر استناد نمایید:
Darvishi M, Tarihi T, Delshad AR, Mesbah Namin AR, Taheri T. Evaluating the function of motoneuron-like cells differentiated from rat adipose derived stem cells through calcium ion imaging and investigating the synaptic vesicle recycling. Pejouhandeh 2013;18(5):254-266.

مقدمه3 است )3(. این اختلالات به دلی عدم توانایی سیستتم عصتب ی
بیماریهای تخریب نورونی از جمله اختلالات ناتوانکنندهای مرکزی در ترمیم و بازسازی با وجود پیشترفت هتای متعتدد در
هستند که در سالهای اخیر مورد توجه محققین قترار گرفتته زمینهی دارویی وجراحی، هنوز به عنوان یک مسألهی پیچیت ده در علوم پزشکی مطتر متیباشتند ) 7(. بی متاری هتای ستلول عصبی- حرکتی (MND: motoneuron diseases) همچون
*شفا، بینويسنده مسمارستان ؤول خاتم الانبیا، مکاتبات: تهران. دکتر نمابر: تقي طريحي؛ 44136544 )مرکز 173(؛تحق یقات پست علتوم الکترونيك:اعصتاب Amyotrophic lateral sclerosis) ALS) با از دست دادن [email protected]
سلولهای عصبی- حرکتی فوقانی و تحتانی ایجاد میشود )1(.
جایگزین کردن سلولهای عصبی- حرکتت ی تخریت ب شتده ، بتاسلولهای القا شده، یکی از روشهتا ی مناستب جهتت بهبتودحرکتی در این بیماران میباشد )4 و 5(. مطالعات اخیر نشتاندادهاند که سلولهای عصبی- حرکتی از منابع مختلف ستلول ی همچون سلولهای بنیادی جنینی، سلولهای بنیادی عصتب ی، سلول بنیادی بالغ و سلولهای برنامهریزی شده مجتدد ، ایجتاد میشوند )9-6(. سلول بنیادی بالغ به علت در دسترس بتودن،عدم محدودیت اخلاقی، عدم رد پیوند و تومتورزا یی بته عنتوانمناسبترین منبع ستلول ی جهتت درمتان مطتر استت) 31(.
سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربت ی بتا توانتایی تمتا یز بتهسمت سلولهای عصبی، نمونهای از ستلول هتا ی بنیت ادی بتالغمیباشند )33 و 37(. این گروه سلولی، دارای توانایی تمایز بتهتمام ردههای سلول مزانشیمی هستند )31(. همچنین، نستبتبه سایر ردههای سلول مزانشیمی، قدرت تکثیر بالاتری داشتته و تا 35 پاساژ پیش میروند )34(. این سلولها، تحت تأثیر القا با دپرنی ، به سمت سلولهای عصبی-حرکتی تمایز متی یابنتد)35(.
مکانیسم تمایز سلولهتا ی عصتب ی- حرکتت ی، بتا استتفاده ازروشهای ایمنوسیتوشیمی و واکنشهای زنجیرهای پلیمتراز و همچنین از طریق بررسی شک سلول، قاب شناسایی هستتند )35(. اما یکی از مواردی کته در ستلول درمتانی اهمیت ت دارد، تولی د س لول دارای عملک رد فیزیولوژی ک اس ت. روشه ای فوقالذکر ،قادر به بیان میزان عملکرد سلولهتا ی تولیت د شتدهنمیباشند و از ایت ن رو، ارائته ی راهکارهتا ی جدیت د بته منوتور بررسی دینامیک بتودن و بته دنبتال آن عملکترد فیزیولوژیت ک س لول، بس یار ح ایز اهمی ت اس ت )36(. بررس ی تب ادلات وزیکولهای ترشحی و تغییرات ستطح کلستیم در ستلول هتا ی تمایز یافته، یکی از روشهتا ی ارزیت ابی میتزان فعالیتت ستلولاست که با استفاده از رنگ آمیزی 43-FM1 و نشانگر کلست یم فلوئوروکروم 2-Fluo انجام مت یگیت رد )32 و 34( . همچنت ین، مطالعات گذشته نشان داده است که سلولهای عصبی حرکتی تولید شده از سلولهای بنیادی مشتتق از بافتت چربتی، دارای قدرت تبادل وزیکولهای ترشحی میباشند .ایت ن یافتته هتا ، بتاروشهای الکتروفیزیولوژی نویر patch-clamp تأیید گردیت ده است، اما این روش فقط یت ک ستلول را در هتر بررستی نشتانمیدهد) 39 و 71(. عتلاوه بتر ایت ن، از روش رنتگ آم یت زی بتا 43-FM1 و روشهای الکتروفیزیولتوژ ی جهتت بررستی بلتو ، تمایز و میزان فعالیت سلولهای عصبی- حرکتی تمایز یافته از سلولهای بنیادی جنینی، استفاده شده است )73(. در چندین
755
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

مطالعه، بترا ی بررست ی اگزوست یتوز و اندوست یتوز درپایانته هتا ی عص بی س لوله ای حرکت ی، از رن گ فلورس نت 43-FM1 استفاده شده استت )77(. درنمونته هتا یی از متوش و قورباغته، پایانههای سلولهای عصبی- حرکتی، با 43-FM1 رنگآمیزی شد و مشخص گردید که این وزیکولها بته صتورت لکتههتا ی فلورس نت ب ا فاص له و ط ول یکس ان ق رار گرفت هان د )71(. همچن ین، بررس یه ای اخی ر نش ان داده ک ه م ی ت وان از نشانگرهای کلسیم، جهت بررسی عملکرد سلول استفاده کترد ، به دلی اینکه در روند تبت ادلات ستلول ی و مهتار وز یکتول هتا ی ترشحی، کلسیم یکی از عناصر مؤثر میباشد. به همین جهتت ، ثبت تغییرات آن میتوانتد تصتویر کلت ی از فعالیت ت ستلول دراختیار قرار دهد )74(. در بررسی انجام شتده در ستال 7131 نشان داده شد که جهت تعیین پتانسی حرکتت ی ستلول هتا ی عصبی مشتق از سلولهای بنیادی جنینی، از نشانگر کلست یمی فلوئوروکروم 4-Fluo استفاده شتده استت. عتلاوه بتر آن، ایت ن روش بتتا استتتفاده از روش هتتای الکتروفیزیولتتوژ ی -(patchclamp) مورد تأیید قرار گرفت )75(. بر ختلا روش -patchclamp که در یک سلول استفاده میشود و روشی بتا تکن یت ک پیچیده و زمانبر میباشد، استفاده از نشتانگرها ی فلورستنت وکلسیمی بسیار ساده و سریع بوده و در عین حال، تراکم بالایی از سلول را در برمت یگیت رد )76(. همچنت ین ایت ن مطالعتات ، بتابررسی عملکرد سلولهای عصبی- حرکتی انسانی با استفاده از 4-Fluo تأیی د ش د )72(. ب ا اینک ه در مطالع ات گذش ته، از سلولهای بنیادی جهت تولید سلولهای شبه عصبی- حرکتی استفاده شده است، ولی منبع مناسب سلولی برای تولیت د ایت ن سلول، بیان نشده است. از آنجا که سلولهتا ی مشتتق از بافتتچربی به راحتت ی در دستترس بتوده و در هتر برداشتت تعتدادزیادی سلول در اختیار قترار متیدهتد ، منبتع مناستبی جهتتسلول درمانی محسوب میشوند. اگر چه در مطالعهای در سال 7133 از ایت ن ستلول بترای تولیت د ستلول هتا ی شتبه عصتبی- حرکتی استفاده شد، ولی به علت به کار بردن دپرنی به عنوان القاکنن ده، می زان تولی د س لول پ ایین ب وده و ع لاوه ب ر آن دینامیک بودن سلول نیز مورد بررسی قرار نگرفته بود. از آنجتاکه در روند سلول درمانی، اهمیت ت کتار در تول یت د ستلول هتا ی فانکشنال و قاب دسترس است، احتیاج به بررسی تکنیکهایی است که بتوان از آنها برای تأیید مطالعات استفاده نمود. هتد از انجام این مطالعه تولید سلولهای فانکشنال عصبی- حرکتی از سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربی بود. در این مطالعته ، جهت بررسی میزان عملکرد سلولهای تمایز یافته، از چنتد ین تکنیک استفاده شده استت . ابتتدا بته منوتور بررستی توانتا یی
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

756
سلولهای تولید شده برای برقراری رابطهی عصتب ی بتا ستلولعضلانی، سلولهای عصبی- حرکتی تمایز یافته از بافت چربی، با سلولهای میوسیت ردهی C2C12 هتم کشتت ی داده شتدند.سپس، جهت بررسی شک گیتری وزیکتولهتای سیناپستی وسرعت ترشح وزیکولهای سیناپسی برای تعیین بلو و فعالیت سلول، از رنتگ آمیت زی 43-FM1 و 2-Fluo استتفاده گردیتد . تاکنون، مطالعهای در زمینهی بررست ی عملکترد ی ستلول هتا ی شبه عصبی- حرکتی با استفاده از 2-Fluo انجام نشده است.

مواد و روشها
برای جداسازی، کشت و تأیید سلولهتا ی بنیت ادی مشتتق ازبافت چربی، از نمونههای بالغ موش صحرایی نر با نژاد wistar و وزن 711-751 گرم استفاده شتد. متوشهتا ی صتحرا یی بتاتزریق داخ صفاقی دوز بالای کتامین و زایلزین بیهوش شدند و پس از باز نمودن پوست و کنار زدن عضلات، چربی ناحیت هی اینگوئینال و اطرا کلیه، جدا گردید. در مرحلته ی جداستاز ی بافت چربی، باید در نور داشته باشیم که عتروق ختونی ناحیت ه دچار پارگی نشود. سپس نمونههای جدا شده در پلیت ت حتاو ی ترکیبات PBS، استرپتومایسین U/ml 311 و پنت یست یلین 3 U/ml 311، قرار داده شد.
پس از شستشوی بافت چربی، بته فتالکون 51 منتقت و بتهمدت 11 دقیقه در معرض 3/1% کلاژناز نوع 4 به همراه PBS و در دمای 12 درجه سانتیگراد قرار داده شد. مخلوط حاصت ، از فیلتر مش با قطر 311 میکرومتر، عبور داده و بته متدت 31 دقیقه، با دور موتور 3711، سانتریفیوژ شد. سپس متا یع رویتی خارج و پلیت سلولی در تته لولتهی فتالکون بتا محتیط کشتت(DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium پیپتاژ شد و مجتدداً بتا دور موتتور 3711، ستانتر یفوژ گردیت د. سانتریفیوژ، به منوور جداسازی ستلول هتا ی ختون ی و چربت ی شناور در محیط انجام گرفت. پلیت نهایی ستلول ، بته فلاستک75 سانتیمتر مربع حاوی محت یط DMEM و سترم منتقت وسپس در 5 درصد 2CO و دمای 12 درجته ستانتیگراد انکوبتهگردید. بعد از 74 ساعت، به منوور جداسازی سلولهای مرده ،شستشو با PBS انجام گرفت و پس از 5 تا 2 روز، سلولها بتهمنوور ایجاد بافت یکنواخت با تریپسین 5% ، از کتف فلاستکجدا و سپس کشت داده شدند. این رونتد بترای 1 تتا 5 پاستاژتکرار شد .
به منوور تأیید سلولهتا ی کشتت داده شتده، یتک میلیت ون سلول در پاساژ ستوم ، بته پل یت ت 6 خانته منتقت و مارکرهتای لیستتت شتتده در جتتدول 3 متتورد بررستت ی قتترار گرفتنتتد. مولتیپوتنسی آنها از طریق انکوبه کردن ستلول هتا در محت یط کش ت تم ایزی استتتخوان، غض رو و چرب ی ارزی ابی ش د .مینرالیزاسیون ماتریکس خارج ستلول ی از طریت ق رنتگ آمیت زی Alizarin red و تمایز به سمت چربی و غضرو ، به ترتیب بتارنگآمیزی Oil red و Safranin O انجام گرفت )74(.
برای تبدی سلولهتا ی بنیت ادی مشتتق از بافتت چربتی بتهسلولهایی با مشخصات سلولهای بنیت ادی عصتب ی، از روشت ی مشابه با Yongfeng و همکارانش با کمی تغییر استتفاده شتد )79(. سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربی، با تریپست ین 5% جدا شتده و بته تعتداد 111/511 ستلول در پل یت ت 6 خانته ی پوششدار شده با پلیالایزین، بته همتراه 7 میلت یلیتتر محت یط
DMEM/F12 (Dulbecco’s modified Eagle’s (medium/Ham’s F-12 medium حاوی سترم 5 درصتد و7 درصد B27، 71 نانوگرم در میلتی لیتتر از bFGF و 71 71 نانوگرم در میلیلیتر از EGF کشت داده شدند. بعد از رسیدن سلولها به ظرفیت 41 درصد، با استفاده از پیپتاژ جدا شدند و این کار تا 1 پاستاژ انجتام شتد. ستپس ستلولهتا بتا تکن یت ک ایمنوسیتوشیمی و RT-PCR بررسی شدند.
برای تبدی سلولهای بنیادی عصتب ی بته ستلولهتا ی شتبهعصبی- حرکتت ی، ستلول هتا ی بنیت ادی عصتب ی در پاستاژ 4-1 انتخاب شدند و برای 5 روز اول در معرض رتینوئیک اسید 3/1 مولار و (sonichedgehog) SHH به صورت 3 میلیگترم بترمیلیلیتتر در محت یط کشتتDMEM/F12 حتاو ی ترکیبتات B27 ،bFGF و EGF قتت رار داده شتت دند. پتت س از 5 روز، فاکتورهتتای رشتتد عصتتب ی شتتام Glial cell derived (neurotrophic factor (GDNF و Brain-derived neurotrophin factors (BDNF) به میزان 31 نانوگرم بترمیلیلیتر و 3-(neurotrophin 3) NT به میزان 5 نانوگرم بر میلیلیتر به محیط اضافه شد) 33(.
سلولهای کشت داده شتده در پلیتت 6 خانته جهتت انجتامتکنیک ایمنوسیتوشتیمی بتاPBS شستشتو و در محلتول 4% پارافرمالدئید برای 11 دقیقه قرار داده شدند. سپس به منوتورنفوذپزیری غشتا ، ستلول هتا بته متدت 35 التی 71 دقیقته ، در محلول تریتون 100-X و 5 درصد سرم، انکوبه شدند. ستپس ، آنتیبادی اولیه لیست شده در جدول 3، به صورت رقیق شتدهدر PBS ، به متدت 37 ستاعت و دمتای 4 درجته ستانتیگرادانکوبه شد. در نهایت، سلولها مجتدد اً بتاPBS شستشتو دادهشده و آنتیبادی ثانویه برای مدت 7 ساعت در دمتای اتتاق درمعرض ستلول قترار گرفتت. بعتد از 1 بتار شستشتو، هستته ی ستلوله ا بتا ترکیتتب پروپیتدیم یدایتد، رنتتگ آمی زی و ب امیکروسکوپ فلورسنت و بزرگنمایی 711 برابر ،مشاهده شدند. به منوور بررسی بیان ژنهتای 1oligo-2 ،islet و HB9 در سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربتی ، ستلول هتای بنیتادیعصبی و سلولهای شبه عصبی حرکتتی و نختاع نتوزاد متوشصحرایی به عنوان کنترل مثبت، از تکنیک RT-PCR استفاده شد. در این روش، RNA ک سلولهای کنترل و تمایز یافتته ، به وسیله کیتتAmbion استتخراج گردیتد و بعتد ازDNA treatment ب ه منو ور جل وگیری از ب روز نت ایج ک اذب، ب ا DNase1 انجام گرفت و محصول به دست آمده بتا استتفاده ازپرایمر oligo-dt به cDNA تبدی شد. سپس، پرایمر ژنهای لیست شده در بالا، با استفاده از نرم افزار primer 3 طراحی و با Gene runner تأیید گردید. در این مطالعته ، GAPDH بتهعنوان ژن داخت ستلولی متورد بررستی قترار گرفتت. ستپسمحصول PCR در دستگاه الکتروفورز و در 3% آگتارز وGEL RED ق رار داده شتد و بان دهای DNA ب ه وس یله دس تگاه GELDOC مشاهده و تصاویر ثبت شدند .این کار برای 1 بتارتکرار شد )11(.
برای تعیین توانایی سلولهای شبه عصبی حرکتی در ایجتاداتصالات عصبی- عضلانی، این سلولها با سلولهای میوبلاست ردهی C2C12 هتتمکشتتتی داده شتتدند. بتترای آمتتاده ستتازی سلولهای C2C12 به مدت 4 روز در محیط کشتتDMEM و سرم 31% قرار داده شدند. پتس از 4 روز، بته منوتور تمتایزسلولها به میوتیوپ، از سرم اسب با غلوت 7% به مدت 5 روز استفاده شد. بعد از تأیید سلولهای میوتیوب، سلولهای شتبهعصبی- حرکتی تولید شده، به مرکز کشت این سلولها اضتافهگردید و بعد از 7 روز، بتا رنتگPKH رنتگ آمیتزی شتد و بتهکمک میکروسکوپ فلورسنت، عکس برداری گردید.
752کنترل منفی سلولها به صورت استتفاده از آنتتیبتادی ثانویتهبدون حضور آنتیبادی اولیه انجام گرفت) 33(.

Rabbit anti-CD49d monoclonal antibody Millipore 3:111 Primary antibody
Mouse anti-CD106 monoclonal antibody Millipore 3:111 Primary antibody
Mouse anti-CD31 monoclonal antibody Millipore 3:711 Primary antibody
Mouse anti-CD90 monoclonal antibody Millipore 3:111 Primary antibody
Mouse anti-NF-68 monoclonal antibody Millipore 3:711 Primary antibody
Mouse anti Neu-N monoclonal antibody Millipore 3:711 Primary antibody
Mouse anti-Neuro D monoclonal antibody Millipore 3:711 Primary antibody
Anti-mouse FITC-conjugated Millipore 3:311 Secondary antibody
Anti-rabbit FITC-conjugate Millipore 3:311 Secondary antibody
Rabbit anti-oligo-2 monoclonal antibody Abcam 3:111 Primary antibody
Rabbit anti-islet-1 monoclonal antibody Abcam 3:111 Primary antibody
Rabbit anti-HB9 monoclonal antibody Abcam 3:111 Primary antibody
51816283245

518162322358

.جدول3. ليست آنتيبادیهای مورد استفاده جهت تعيين ايمنوسيتوشيمي
ب ه منو ور بررس ی حرک ت و رون د ترش حی وزیک وله ای سیناپستتی و همچنتتین بررستتی اگزوستتیتوز و اندوستتیتوز درسلولهای شبه عصبی- حرکتی، از نشتانگر فلورستنت -FM143 استفاده شد. میزان رنگآمیزی بتا 43-FM1 بته وستیلهی میکروسکوپ فلورسنت، مورد بررسی قرار گرفت. نمونهها برای این منوور شسته شدند و بترای 31 دقیقته در محلتول نمکتیح اوی 321 میل یم ولار NaCl، 1/5 میل یم ولار KCl، 1/4 میلتتتیمتتتولار 4KH2PO، 5 میلتتتیمتتتولار 3NaHCO، 3/7 میلیمولار 4Na2SO، 3/7 میلیمولار MgCl2، 3/1 میلیمولار CaCl2، 5 میلیمولار گلوکز و 71 میلیمولار تریس بافر قترارداده شدند. سپس محلول فوق با محلول تحریکی 3 که شتام ترکیب نمکی با 311 میلیمولار KCl و 31 میکرومتولارFM 43-1 است، تعویض گردید. این ترکیب بته متدت 7 دقیقته درمعرض محلول تحریکی قرار داده میشود. سپس این محلول با محل ول تحریک ی 7 ک ه ش ام 5/1 میل یم ولار KCl و 31 میکرومولار 43-FM 1 میباشد، تعویض شده و این محلول بتهمدت 1 دقیقه در مجاورت سلول قرار میگیرد. برای بتی رنتگکتتردن، از محلتتول 311 میلتتیمتتولار KCl استتتفاده شتتد.عکسبرداری با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت و به صتورتیک عکس در هر دقیقه تا 31 عکس گرفته شد )71(.
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

کلس یم داخ س لولی ب ا اس تفاده از ان دازهگی ری ش دت فلورسنت از سلولهای رنگ شده با نشانگر کلستیم 2-FLUO در سلولهای شبه عصبی- حرکتی کشت داده شتده در پلیتت74 خانه تعیین شد. برای این منوور سلولهای بنیادی عصبی مشتق شده از نوروسفر با تعداد 75111 ستلول ، بته پلیتت 74 خانه منتق شد و سپس مراح تمایز سلولی به ستمت تولیتدسلولهای شبه عصبی- حرکتتی انجتام گرفتت. بعتد از تمتایز
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

754
سلولها، محیط سلول تخلیه و سلولها 1 بار بتا محلتولPBS شستشو داده شتد . جهتت رنتگ آمیتزی، 311 میکرومتولار از محلول رنگ آمیزی 2-FLUO )5/7 میلیمولار( به هتر پلیتتاضافه گردید. پلیتهتا ابتتدا بترای 11 دقیقته در 12 درجته وسپس برای 11 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند. در انتهتا ، سلولها با میکروسکوپ فلورسنت در طول متوج 494 نتانومترمورد بررسی قرار گرفته و تصاویر ثبت شدند )75(.
جهت بررسی آماری، از نرم افزار SPSS )نسخه 36( استفاده گردید و خطای معیت ار )SEM( و تستت آمتاری One Way (ANOVA (Tukey ب ا س طح معن اداری 15/1P< در نو ر گرفته شد.

يافتهها
سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربی جدا شتده از اطترا
کلیه، 74 ساعت بعد از کشت به صورت کروی دیده میشوند و

به ترتیب 6/52/92 و 6/74/92 درصد بوده است )شک های 7 و 1(.
سلولهای شبه عصتبی حرکتتی تولیتد شتده از ستلولهتایبنیادی عصبی بعتد از گذشتت 37 روز القتا توستط رتینوییتکاستتید و SHH و ستتپس فاکتورهتتای رشتتد عصتتبی، از نوتتر مورفولوژی مورد بررسی قرار گرفته و نتایج نشان داد



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید