پژوهنده )مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي(
تاریخ دریافت مقاله: 27/9/1991 سال هجدهم، شماره مرداد 3و، پي در شهریور پي 833332، صفحات 821 تا 832 تاریخ پذیرش مقاله: 19/6/1992
بررسي سازگاري غشاهاي غير قابل جذب در برابر سلولهاي فيبروبلاست ليگامان پریودنتال انساني
دکتر محمود قاسمي8، دکتر طاهره فروتن*2، دکتر مليحه نيکزاد3

دانشيار، گروه پريودنتولوژي، دانشکده دندانپزشکي، دانشگاه آزاد اسلامي تهران
استاديار گروه زيست شناسي جانوري، دانشکدة علوم زيستي، دانشگاه خوارزمي
-10515207612

9. دندانپزشک عمومي چکيده
سابقه و هدف: تاکنون انواع مختلفي از غشاهاي غير قابل جذب به منظور بازسازي ساختار بافت پريودنتال آسيب ديده مورد استفاده قرار گرفته است. هدف از مطالعهي تجربي حاضر، مقايسهي انواع غشاهاي غير قابل جذب از نظر ميزان و نحوهي چسبندگي سلولهاي PDL (perio dental ligament) انساني در محيط آزمايشگاهي ميباشد. براي نيل به اين هدف، ميزان نرخ بقاء، واکنش آلکالين فسفاتاز و مورفولوژي سلولها پس از مجاورت با غشاهاي مورد نظر، بررسي شدند.
مواد و روشها: سه غشاي غير قابل جذب 200-TXT-200 ،GBR و IMTEC OVID مورد مطالعه قرار گرفتند. سلولهاي فيبروبلاست جدا شده از PDL دندانهاي پرمولر با دانسيتهي cell/ml 104 در محيط کشت بر روي غشاها با ابعاد 99 ميليمتر در 11 چاهک براي 22 ساعت انکوبه گرديد. سپس نمونهها براي ارزيابي توسط ميکروسکوپ نوري و الکتروني فيکس شدند. دادهها بوسيلهي آزمون آماري one-way ANOVA آناليز گرديدند.
یافتهها: نتايج نشان داد که از 9 غشاي مورد بررسي، غشاهاي 200-TXT و 200-GBR بيشترين ميزان چسبندگي را به لحاظ مورفولوژي داشته و کمترين چسبندگي مربوط به غشاي IMTEC OVID بود که اين تفاوت از نظر آماري معنيدار بود )22/2p=(.
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- و ALP (alkaline phosphatase) همچنين، ميزان چسبندگي سلولها از نظر شاخص
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

(Diphenyltetrazolium Bromide-5,2، بر روي غشاهاي 200-TXT و 200-GBR بيشتر از گروه ديگر بود، اما اين تفاوت از نظر آماري معنيدار نبود )به ترتيب 2/2p= و 20/2p=(.
نتيجهگيري: به نظر ميرسد غشاهاي 200-TXT و 200-GBR نتايج بهتري را در تغييرات مورفولوژيک سلولهاي فيبروبلاست در محيط کشت نشان دادند. شايد علت معنيدار نبودن شاخصهاي ALP و MTT ، کم بودن تعداد سلولهاي چسبيده به غشاها باشد که در نتيجه امکان اندازهگيري دقيق اين شاخصها را ميسر نميساخت.

-18135233275

واژگان کليدي: غشاي غير قابل جذب، چسبندگي سلولي، بازسازي پريودنتال، نرخ بقاي سلولي، فعاليت آلکالين فسفاتاز لطفاً به اين مقاله به صورت زير استناد نماييد:
Ghasemi M, Foroutan T, Nikzad M. The study of non-absorbable membrane compatibility to human fibroblast
periodontal ligament. Pejouhandeh 2013;:)3(81128-132.
1524862

مقدمه8
روشهاي درماني متداول بيماريهاي پريودنتال در جهت حذف پلاک ميکروبي و التهاب معطوف گشت ته است ت. اين روشها تقريباً هميش ه ش امل جرمگيري و ص اف و صتيقلي نمودن سطح ريشه و گاهي هم جراحيهاي پريودنتال بوده

*نویسنده مسؤول مکاتبات: دکتر طاهره فروتن؛ استاديار گروه زيست شناسي جتانوري، دانشتتتکتدة علوم زيستتتتي، دانشتتتگتاه خوارزمي؛ پستتت الکتروني :
[email protected]
اس ت. اعمال فوق به همراه بهداش ت مناس ب بيمار غالباً باعث ثبات بافت باقيمانده پريودنشيوم ميگردد )9-1(. اين در حالي است ت که مهمترين هدف درمانهاي پريودنتال، در راست تاي فراهم کردن شرايط بازسازي مجدد پريودنشيوم آسيب ديده و يا از دست رفته ميباشد )1(.
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

مطتالعات نشتتتان داده استتتت که پس از انجام جراحيهاي پريودنتال، ستلول هاي اپيتليال ستريعترين رشد را داشته و در حالي زودتر از س اير س لولهاي پريودنش يوم در س طح عريان ريشتته تجمع مييابند که اين امر بازستتازي بافتي را به همراه نداشتته و باعث ميشتود بافتي با يک اپيتليوم طويل چسبنده بر روي سطح ريشه ترميم شود) 2-1(.
Victo و همکارانش طي تحقيقي در ستتال 1902 نشتتان دادند سلولهايي از پريودنشيوم که از ليگامان پريودنتال منشاء گرفتته انتد )بت ه ويژه فيبروبلاستتتتها( ميتوانند بهترين نوع چسبندگي و بازسازي بافتي را ايجاد کنند )1(. در اين خصوص اس تفاده از غش اهاي مختلف پيش نهاد گرديده اس ت. غش اها داراي خصتتوصتتيات ي همچون يکپارچگي، ستتازگاري زيستتتي، مسدود کنندگي سلولي براي سلولهاي non-regenerative، فضتاستازي جهت مهاجرت سلولها و قابليت سازگاري با بافت ميباشند )6(. با توجه به اين خصوصيات، ميتوان با قرار دادن غشتتاء بين ستتطح عريان ريشتته و بافت همبند در طي ترميم متعاقب جراحي پريودنتال، از رشتد اپيکالي سلولهاي اپي تليوم و بتافت همبند جلوگيري کرده و با ايجاد فضتتتا، به مهاجرت و تجمع ستتتلولهايي مانند فيبروبلاستتتتها که منشتتتا ليگمان پريودنتالي داشته و توانايي لازم جهت بازسازي را دارند، کمک نمود )9-7(. اين امر براي نخستتتتين بار توستتتط Lindehy karring Nyman در سال 1902 مورد تأييد قرار گرفت )12(.
در تحقيقاتي که طي سالهاي اخير صورت گرفته، مشخص شتده اس ت که پارامترهاي غش اها از جمله نحوهي قرارگيري فايبرها، ضتتخامت فايبرها و ميزان خلل و فرج موجود در آنها ميتواننتد مقتادير متفتاوتي از ميزان چستتتبندگي و تکثير فيبروبلاستتي را در ستطح غشاها ايجاد کنند) 1، 2 و 11(. در تحقيقي که توسط Kasaj و همکارانش در سال 2220 بر روي انواع غشاهاي قابل جذب و غير قابل جذب صورت گرفت نشان داده شتتد که مقادير متفاوتي از چستتبندگي بر روي هر يک ازانواع غشتتاها رخ ميدهد. لذا در اين تحقيق بر آن شتتديم که تأثير 9 نوع از غشتتتاهاي غير قابل جذب را در ميزان و نحوهي چسبندگي فيبروبلاستهاي ليگامان پريودنتال انساني در محيط in vitro مورد بررس ي قرار دهيم. مطالعهي حاض ر در س ال 1909 در آزمايشگاه کشت سلولي دانشگاه خوارزمي انجام شد.
مواد و روشها
در اين تحقيق تجربي، ليگتامان پريودنتال 2 دندان پره مولر ب ا کتورت ج دا شتتتتده و در محلول DMEM (double
شماره 9، پيدرپي 99، مرداد و شهريور 1992 دکتر طاهره فروتن و همکاران/129
modified eagle medium) که شت امل 1% پنيست يلين- استرپتومايسين و 12% سرم گاوي جنيني است، قرار داده شد. س پس، آنها در مدت زمان کمتر از يک س اعت به آزمايش گاه منتقل شده و سلولهاي فيبروبلاست پس از جداسازي در طي سه- چهار پاساژ، با دانسيتهي 2cell/cm 122 بر روي غشاهاي موجود در پليتهاي22 خانه حاوي محيط کشتتتت که از 22 ستاعت قبل با اشتعهUV استتريل شتده بودند، ريخته شدند. ابعاد غشتتاهاي قابل جذب مورد استتتفاده در اين تحقيق 9×9 ميليمتر و ش امل انواع 200-TXT-200 ،GBR و IMTEC OVID بود. شتش خانه از پليت ها به هر يک از 2 غشاي قابل جذب اختصاص يافت. تمامي خانهها پس از شستشو با محلول بافر، توستتط محلول DMEM جايگزين شتتدند. پليتها در دماي 97 درجه و در هواي مرطوب با 1% 2CO به مدت 22 ساعت انکوبه شدند.
تست آلکالين فسفاتاز:
تست ت فعاليت آلکالين فست فاتاز به عنوان يک پارامتر براي فعاليت س لولي به خص وص س لولهاي اس تبوبلاس تي مطر استتتت. براي اين منظور از کيت ستتتنجش آلکالين فستتتفاتاز(Product No. 85, Sigma-Aldrich) استتتفاده گرديد. در روش فوق، سلولها بوسيلهي محلول تثبيتکنندهي سيترات- استتتن، به مدت 92 ثانيه تثبيت شتتده و ستتپس به مدت 92 دقيق ه در معرم محلول نم ک دي ازونيوم قرار گرف ت. در مرحلهي بعد، سلولها دو بار با آب مقطر شسته شده و به مدت 9 دقيقه با محلول هماتوکس يلين رنگآميزي ش دند. س پس س لولها در زير ميکروس کوپ نوري مورد مطالعه قرار گرفتند.
در تجزيته و تحليتل آمتاري و به منظور بررستتتي اختلاف بينگروهه ا ،از آزمون آن اليز واري انس ي ک طرف ه ne-way o)(ANOVA استفاده گرديد.
:MTT تست
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

به منظور ست نجش نرخ بقاي ست لولها، از تست ت MTT استتفاده گرديد. اين تست براي سنجش ميزان يا نسبت تکثير ستلولي کاربرد د اشتته و بر اس ار روش رنگسنجي بر پايهي احيا و شتکستته شتدن کريستالهاي آبي رنگ فورمازان انجام ميگيرد. لازم به ذکر استت که حساسيت اين روش بالاي 90٪ ميباشتد . پس از اتمام انکوباستيون ، تستتMTT به شر زير انجام گرفت: ابتدا محيط کشت رويي دور ريخته شد و هر کدام از خانههاي حاوي غشتتتاها به طور کامل با PBS استتتتريل شستشو داده شدند. سپس 122 لاندا محيط حاوي MTT به هرخانه اضتتافه گرديد و به مدت 2 ستتاعت در انکوباتور حاوي 2CO در دماي 97 درجه ستانتي گراد قرار داده شدند. در طي انکوباستتيون، محلول MTT توستتط ستتيستتتم ستتوکستتيناتدهيدروژناز، احيا شتتد .پس از 2 ستتاعت، مايع روي هر غشتتا مجدداً برداشتته و باPBS اس تريل شستشو داده شد و سپس 122 لانتدا ايزوپروپتانول استتتيتديتک 2/2% همراه بتا استتتيد هيدروکلريک به هر خانه اضتافه گرديد. انکوباسيون در حرارتاتاق و دور از نور به مدت 12 دقيقه انجام شت د. الکل باعث ليز ستيتوپلاستم ستلولي شده و در نتيجه فورمازان غير محلول از ستيتوپلاسم سلو ل خارج ميگردد. به اين ترتيب، رنگ تشکيل ش ده را محلول نموده و باعث رنگي ش دن محيط ميش ود. در نهايت، جذب نوري محلول به دستتتت آمده در طول موج 692 نانومتر به عنوان طول موج مرجع و 172 نانومتر به عنوان طول موج ست نجش جهت اطمينان از صت حت نتايج، در دستتتگاه Elisa Reader به ثبت رسيد .

جدول 8. توزیع نمونههاي مورد بررسي بر حسب مورفولوژي سلولي به تفکي غشاها.

176784-44760

نام غشاء مورفولوژي
ميزان سلولهاي پهن ميزان سلولهاي گرد ميزان سلولهاي دوکي
9/62  2/72 0/22  2/12 0  2/62 TXT 200
11/22  2/90 9/22  2/92 0  1/10 GBR-200
10  9/19 2/22  1/92 2/2  1/92 IMTEC OVID
10/02  2/20 0/22  2/61 10/22 2/96 CD

دادهها به صورت ميانگين  انحراف معيار (SD) بيان شدهاند.

جدول شماره 2. توزیع نمونههاي مورد بررسي بر حسب شاخص MTT و آلکالين فسفاتاز به تفکي غشاها.
ميزان ALP ميزان MTT نام غشاء
26/6  7/72 2/922  2/17 TXT 200
29/0  19/79 2/269  2/922 GBR-200
92  6/67 2/201  2/212 IMTEC OVID
2/910  2/22 CD
دادهها به صورت ميانگين  انحراف معيار (SD) بيان شدهاند. ALP: آلکالين فسفاتاز.
در تجزيه و تحليل آماري و به منظور بررستتتي اختلاف بين گروهه ا ،از آزمون آن اليز واري انس ي ک طرف ه (one-way ANOVA) استفاده گرديد.
192/ دوماهنامه پژوهنده سازگاري غشاهاي غير قابل جذب در برابر سلولهاي فيبروبلاست …
یافتهها
در اين مطالعه از س ه نوع غش اي غير قابل جذب به نامهاي 200-TXT-200 ،GBR و IMTEC OVID اس تفاده گرديد. در ميان غشتاها ، بيشتترين تعداد ستلولهاي پهن در غشاهاي TXT 200 ب ه تع داد 62/20 و 200-GBR ب ه تع داد
10/10، و کمترين آنها در غشاي IMTEC OVID به تعداد
92/12/2 مشتتتاهتده گرديد )جدول 1(. آزمون آماري one way ANOVA اختلاف بين گروه ه ا را از نظر مورفولوژي معنيدار نشان داد )221/2p<( )شکل 1(.
س ه گروه ذکر ش ده از نظر نرخ بقا و ميزان تکثير س لولي و واکنش نستتتبتت بته رنتگآميزي آلکتالين فستتتفتاتاز، تفاوت معنيداري بتا يکتديگر نشتتتان ندادند )به ترتيب 20/2p= و 12/2p=( )جدول 2 و شکل 2(.

شکل 1. سلولهاي فيبروبلاست دندان پره مولرِ کشت شده در محيط DMEM. بزرگنمايي 122×.

شکل 2. سلولهاي فيبروبلاست دندان پره مولرِ رنگ شده با آلکالين فسفاتاز. تودههاي رنگي نشاندهندهي واکنش مثبت به کيت آلکالين فسفاتاز ميباشد. بزرگنمايي 222×.

1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018

بحث
در مطالعهي حاضتتتر، تأثير انواع غشتتتاهاي غير قابل جذب
شتامل 9 غشاي 200-TXT 200 ،GBR و IMTEC OVID بر مقدار و نحوهي چستبندگي ستلولهاي فيبروبلاست ليگمان پريودنتتال انستتتاني مورد بررستتتي قرار گرفتت . يافتههاي اين تحقيق مبين آن استت که غشاهاي TXT 200 و 200-GBR نتايج بهتري در تغييرات مورفولوژيک ستلول هاي فيبروبلاس ت در محيط کشت از خود نشان ميدهند.
Change و همکارانش چسبندگي سلولي فيبروبلاست را به غشاهاي قابل جذب inion GTRX با بيسپليلاکتيک اسيد و غشاي غير قابل جذب GTN1 (gore-Tex) با بيس ePTFE(expanded Polytetrafluoroethylene) بررستتتي کرده و نشتان دادند که چگونه چستبندگي فيبروبلاستها به غشاهاي مختلف تحت تأثير فاکتورهاي خارجي مثل PRP (platelet rich plasma) ميباشد. در ميان غشاهاي بررسي شده، غشاي Inion بيشترين ميزان چسبندگي و غشاي ePTEF کمترين ميزان چستبندگي را نشتان داد) 1(. سلولهاي ستارهاي شکل پهن با فاصتله کم در س راستر غشتا ي Inion مش اهده گرديد )محدوده هر دو سلول کمتر از 22 سلول بود(. اين چسبندگي متفاوت س لولها به غش اها، به علت س اختار ميکروس کوپي غشتتاها بود .به اين معني که ستتطو ناصتتاف و داراي تخلل، ميزان چستتتبندگي را به طور خاصتتتي تحت تأثير قرار داده و غشتا ي Inion با س ايز متفاوت فايبرها و ستاختار ش بکه اي با خشتونت ستطحي ، مطلوبترين چسبندگي سلولها را از خود نشتان داد. همچنين سميت غشاها، اثر مهاري روي چسبندگي ستلول ها داشتته و غشاي ePTFG داراي سميت متوسط بوده که ستبب کاهش پتانستيل چستبندگي شده است. در تحقيق حاضتتر، غشتتاهاي غير قابل جذب به دليل بيس ePTFG و ستتميت، داراي کمترين چستتبندگي ستتلولي بودند ولي با اين وجود ،بيشترين ميزان چسبندگي سلولي به لحاظ موروفولوژي ستلولي بر روي غشا هاي 200-GBR و 200-TXT و کمترين ميزان چسبندگي در غشاي IMTEC OVID مشاهده گرديد.
Takata و همکارانش چستبندگي سلول هاي فيبروبلاست بت ه غشتتتاهاي قابل جذب Tissue guide (TG) و Bio mend (BM) را ب ا بيسکلاژن و resoulote ،Epiguide را با بيسلاکتيک استتتيد و غشتتتاي غير قابل جذب Gortex مقايسته و نشتان دادند که ميزان چسبندگي فيبروبلاستها به غشتاهاي قابل جذب بيشتتر از غشتاهاي غير قابل جذب است )6(. در مطالعهي حاضتر ، مهمترين فاکتور در بين خصتوصي ات غشاها که منجر به چسبندگي ايدهآل ميشود، سازگاري بافتي

شماره 9، پيدرپي 99، مرداد و شهريور 1992 دکتر طاهره فروتن و همکاران/191
غشت اها بود، اما حضت ور عوامل ديگر مانند ست ميت غشت اها ،محتويات غشتا ء، شتکل و ستاختار آنها، و همچنين سايز تخللغشاها را نيز مؤثر ميدانيم.
در ميان غشتتاهاي قابل جذب، 200-GBR به دليل تخلخل بيشتتر ، ميزان چستبندگي بيشتري از خود نشان داد. بنابراين شتکل و ستاختار سطحي غشاء به عنوان عاملي در چسبندگي مورد بررس ي قرار گرفت. در واقع، تخلخلها به عنوان بس تري جهتت بت ه دام انتداختن لختته ي خوني عمل کرده و تهاجم ستلول ها به بستر را تحت تأثير قرار ميدهند )12(. در مطالعه حاضتر نيز چستبندگي بيشتتر فيبروبلاستت ها به غشاهاي غير قتابل جذب 200-GBR و 200-TXT تأييد گرديد و فعاليت آلکالين فسفاتاز و MTT به علت چسبندگي کمتر سلولها در نتيجهي سميت متوسط غشاهاي ePTFE ، معنيدار نبود.
Adrian Kasaj و همکارانش، چستتتبندگي ستتتلولهاي فيبروبلاست را بر روي غشاهاي قابل جذب Totudent (TD)، Resodont (RD) و Bio Gide (BG) را ب ا بيسکلاژني و غشتاهاي غير قابل جذب را با بيسePTFE مورد مقايسه قرار داده و دريتافتند که غشتتتاهاي قابل جذب همگي افزايش قابل توجهي در ميزان چستبندگي ستلولها از خود نشان ميدهند .در در همين ارتباط، غش اي TD بيش ترين ميزان چس بندگي ستلولي را در بين غشاها به خود اختصاص داده است )2(. علت اين امر را تشتتتديد تکثير ستتتلولي و ماکرومولکولهاي خارج ستلولي توسط غشاهاي قابل جذب کلاژنه دانستهاند )19(. اين تحقيق همچنين ستتايز تخلخلها و خشتتونت ستتطحي را در چستب ندگي ستلول ها موثر دانسته و همچنين بيان ميکند که محيط in vitro نميتواند نقش شترايط in vivo را بازس ازي کند. در مطالعهي حاضر نيز چسبندگي کمتر فيبروبلاستها به غشاهاي غير قابل جذب تأييد گرديد و فعاليت آلکالين فسفاتاز و MTT به علت چستبندگي کمترل ستلولها ناشي از سميت متوسط غشاهاي ePTFE معنيدار نبود.
Alpar و همکارانش، ستازگاري زيستي دو نوع غشا ي قابل جذب شتاملguide و Bio guide و غش اي غير قابل جذب Gor-Tex را با کلاژن مورد بررسي قرار دادند. در اين تحقيق نيز مشخص شد که غشاهاي قابل جذب سازگاري بافتي بسيار خوبي از خود نشان ميدهند، در حالي که غشاهاي ePTFE و پلي لاکتيک استيد ، سازگاري بافتي متوسط تا خفيف داشته و باعث مرگ سلولي ميشوند. اين غشاها همچنين سبب واکنش جستم خارجي توستط ميزبان شتده و رشد اپيکالي اپيتيليال وميکروبي را روي اين دو غشتتاء تستتهيل مي کنند که اين امر باعتث ايجاد فاصله بيتن سلولها و غشاء شده و هدف GTR را کاهش ميدهند )7(.
در تحقيق حاضتتر نيز به دليل ستتميت غشتتاهاي غير قابلجتذب بتا بيسePTFE ، ستتتنتز DNA و ماکرومولکولهاي خارج ستلولي توستط غشتاها مختل شده و چسبندگي سلولي کتمتري رخ ميدهتد. همچنين بته علتت کم بودن تعتداد س لولهاي چس بيده، آزمون MTT و آلکالين فس فاتاز از نظر آماري معنيدار نبود.

1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:08 +0330 on Wednesday January 10th 2018



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید