پژوهنده )مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي(
تاريخ دريافت مقاله: 42/24/2192 سال هجدهم، شماره 2خرداد ، و پي تير در 92پي 231 9، صفحات 99 تا 57 تاريخ پذيرش مقاله: 5/2/2194
بررسي تأثير مقادير مختلف زهر زنبور عسل بر سطح سرمي اينترلوکين 9 در رتهای لوئيس EAE )مدلي برای مطالعه مالتيپل اسکلروزيس(
دکتر پريچهر يغمائي3، دکتر محمد نبيوني2، دکتر مهدی مهدوی1، طاهره مهرورز*4، زهرا نظری7

2. دانشیار، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم تحقیقات تهران
4. استادیار، گروه سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران
استادیار، گروه ویروس شناسی، انستیتو پاستور تهران
کارشناس ارشد فیزیولوژی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم تحقیقات تهران
-10667207611

5. دانشجوی دکتری، گروه سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران چکيده
سابقه و هدف: مالتیپل اسکلروزیس یک بیماری خودایمنی سیستم عصبی مرکزی است. آنسفالومیلیتیس آلرژیکک تجربکی (EAE) مکد مناسبی برای بیماری MS میباشد. با توجه به اینکه در مطالعات قبلی زهر زنبور عسل (BV) توانسته است بیکان فکاکتور التهکابیTNFα را کاهش دهد، در این مطالعه فرض بر این بود که زهر زنبور بتواند با کاهش سطح سرمی اینترلوکین 6، جهت درمان MS به کار رود.
مواد و روشها: رتها با امولسیون نخاع خوکچه هندی و ادجوانت کامل فروند ایمیونیزه شدند. اولین نشانههکای بیمکاری 9 روز پکس ازایمیونیزه شدن نشان داده شد. رتهای مورد آزمایش به چهار گروه تقسیم شدند: گروه کنتر ، گکروه تجربکی او شکامل رتهکای القکاشده و درمان شده 2 میلیگرم در هر کیلوگرم وزن بدن، گروه تجربی دوم شامل رتهای القا شده با درمان 4 میلیگرم در هر کیلکوگرموزن بدن و گروه شم. علائم کلینیکی در هر روز درمان بررسی شدند. همچنین سکرم خکون جهکت بررسکی سکطح 6IL بکه رو اییکزاجمعآوری شد. بافت مغز حاصل از هر چهار گروه نیز جهت بررسیهای بافتی استخراج شد. جهت تجزیه و تحلیل آماری دادهها از آزمون
.استفاده شد one-way ANOVA
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

يافتهها: نتایج حاصل از رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین نشان داد که در گروههای تیمار شده توسط BV میزان التهاب بافت عصکبیکاهش مییابد. نتایج تست اییزا نیز افزایش سطح 6IL در گروه شم )402 پیکوگرم بر میلیلیتر( و کاهش آن در گروههای درمان شکده)به ترتیب 202 و 00 پیکوگرم بر میلیلیتر برای گروههای درمان شده توسط 2 و 4 میلیگرم زهر زنبور( را نشان داد.
نتيجهگيری: به نظر میرسد که BV موجب کاهش سطح سرمی سیتوکاین 6IL در مد EAE رت میشود. همچنکین نشکان داده شکدکه در حیوانات تیمار شده توسط BV علائم کلینیکی بیماری کاهش مییابد. بنابراین توصیه میشود اثرات زهر زنبکور در مبتلایکان بکهMS نیز مورد بررسی قرار گیرد.

-18287233442

واژگان کليدی: آنسفالومیلیتیس آلرژیک تجربی، مالتیپل اسکلروزیس، زهر زنبور عسل ،6IL لطفاً به این مقاله به صورت زیر استناد نمایید:
Yaghmaei P, Nabiuni M, Mahdavi M, Mehrvarz T, Nazari Z. The effects of honey bee venom on the serum interleukin 6 level in EAE Lewis rats; a model for the study of multiple sclerosis. Pejouhandeh 2013;18(2):69-.57
04862

مقدمه3
MS یک بیماری مزمن سیستم عصبی مرکزی اسکت ککه بکامولتی دمیلینه شدن التهابی و نقصان میلینی همراه است) 2(.
این بیماری معمویً در سکنین 20-40 سکالگی فکرد را گرفتکار

*نويسنده مسؤول مکاتبات: طاهره مهررورز ؛ تهکران ، پونکک ، انتهکا ی بزرگکراهاشرفی اصفهانی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم تحقیقات، دانشککده علکوم؛ تلفکن:
[email protected] :؛ پست الکترونيك+90-924-6656252

میکند) 4(. یافتههای اخیر نشان میدهد که ایجاد خکودایمنیدر افراد به ترکیبی از عوامل محیطکی و ژنتیککی بسکتگی دارد)1(. MS باعث اختلا در عملکرد حسی و حرکتی، اتونومیککو درک عصککبی شککخ مککیگککردد. سککلو هککای +TCD4 خودواکنشگر، نقش محوری را در پکاتوژنز بیمکاری دارنک د) 2(. اغلب مطالعاتی که برای شناسایی سلو های T اختصاصی علیه
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

00
myelin basic protein( MBP( و یکا (proteo lipid protein)PLP صورت گرفتهاند، نشاندهنده افزایش تعداد این سلو هکادر افراد مبتلا به MS در مقایسه با افراد سالم میباشند. به نظر میرسد که عوامل دیگری همچون ایمنی ذاتی و افزایش بیکانبرخککی مولکککو هککای کمککک تحریکککی و افککزایش ترشککحسیتوکاینهای پیشالتهابی در فعا شدن و افزایش تعداد ایکنسلو ها مؤثر باشد )5(. در آنسفالومیلیت تجربی تأکید بر روی کاراکترهای نوروایمنولوژیکی است که با بیماری درگیر هستند کککه از آن جملککه مککی تککوان سککیتوکاین هککا، کموکککاینهککا و مولکو های چسبنده را نام برد) 2(. سیتوکاینها را میتوان به دو شکل پیشالتهابی و التهابی تقسیم نمکود. چنکین اسکتنتاجمیشود که بیماری MS یک بیماری خودایمن بکا الگکویTh1 بوده و سیتوکاینهای التهابی مربوطه، در تشدید علایم و بکروزضایعات، نقش برجستهای دارند) 6(. اینترلوکین 6 )6IL( نقش م ؤثری در پ اتوژنز آنس فالومیلیت تجرب ی دارد) 0(. بررس یها نشان دادهاند که آنتیبادی ضد 6IL در کاهش اثرات آنسکفالیتآلرژیک تجربی) EAE( در مو مکؤثر اسکت. 6IL سکیتوکاینیدارای چندین عملکرد در سیستم دفاعی بیماریهای خودایمنی است. همچنین میتواند پاسخ فاز حاد کبدی را در جهکت القکا تولید ایمنوگلوبولینها از سلو های B و نیز ترشکح 2IL ککه ازرشد سلو های T حاصل میشود را میسکر سکازد. 6IL توسکطلنفوسیتها و مونوسیتها در سیستم ایمنکی تولیکد مکیشکود . مدارکی نیز دا بکر نقکش ایکن سکیتوکاین در مکد EAE در رتهای لوئیس که مد شبیه به MS است را نشکان مکیدهکد)0(. نقش تکرانس سکیگنالینگ 6IL در مکد هکای حیکوانی درشرایط in vivo در بیماریهکای التهکابی ماننکد التهکاب صکفا، آرتریت روماتوئید و سرطان روده بزرگ نشان داده شکده اسکت)9(. نقش 6IL در فعالیت MBP در رتهای لکوئیس القکا شکدهEAE نشان داده شده است. در مد فعا MBP-EAE اگرچه ترانس سیگنالینگ 6IL نمیتواند نقش عمدهای در سکلو هکای T داشته باشد، ولی نقش محوری و اساسی را در تولیکدTh17 دارد) 20(. بسیاری از مفاهیم فعلی مکا در مکورد بیمکاریMS مربوط است به یافتههای محققین در مد حیوانی این بیماری که ما آن را تحت عنوان آنسفالیت آلرژیک تجربی میشناسیم .
مد EAE اولین بار در سا 2005 با واکسیناسیون خرگکو سالم با نخاع خرگو مبتلا به هاری توسط لوئی پاستور ارائکهگردید) 22(. EAE یک مد مناسب برای بررسکی شاخصکهایالتهابی در بیماری MS میباشد ککه در ایکن مکد حیکوان درمعرض مستقیم سلو های T بر علیه آنتیژنهای میلینی و القا دمیلیناسیون قرار میگیرد) 24(. زهر زنبور عسل) BV( حاوی پ روتنینه ا و پپتی دهای مختلف ی نظی ر ملیت ین، آپ امین،فسفولیپاز 2A، و هیالورونیداز است که یک تحریک کننده قکویسیستم دفاعی جاندار هدف میباشکد )21(. ایکن مکاده بکا بکایبردن سطح کورتیکواسکتروئیدها، مکیتوانکد تکأثیر بسکزایی دردرمان بیماریهای مفاصل داشته باشد. همچنین بکا القکا ترشکحکاتکو آمینها از غدد فکو کلیکه تکأثیر ضکد التهکابی خکود رااعما میکند )22(. اگر چه تزریک BV در تخفیکف دردهکایتونیک و افزایش حساسیت به درد مؤثر است؛ ولی مدارکی نیز دا بککر اثککرات ضککد التهککابی و ضککد دردی ایککن ترکیککب درواکنشهای التهابی وجود دارد .
در این مطالعه القا دمیلیناسکیون بکه رو EAE و التهکاب وتأثیرگذاری زهر زنبور عسل بر میزان سکیتوکین پکیش التهکابی 6IL در سرم خون مورد بررسکی قکرار گرفکت. ایکن تحقیک در آزمایشگاه تحقیقاتی سکلولی تککوینی دانشککده علکوم زیسکتی دانشک گاه خک وارزمی و مرکک ز تکثیک ر و پک رور حیوانک ات آزمایش گاهی ای ن دانش گاه در س ا تحص یلی 92-90 انج ام گرفت.

مواد و روشها
تحقی حاضر به رو تجربی و جامعه مکورد بررسکی شکامل
20 سر رت ماده نژاد لوئیس تهیه شده از شرکت داروپخش بکهوزن40±200 گرم بود. رتها با نخکاع خوکچکه هنکدی )تهیکهشده از مؤسسه سرمسازی رازی کرج(، و ادجوانت کامل فرونکد)Sigma F5881 ,CFA( که حاوی مایکوباکتریاهای کشته شده در امولسیون آب و روغن میباشکد ایمیکونیزه شکدند. در ابتکداخوکچههای هندی توسط کلروفورم بیهو شدند. نخاع خکارجشده در پتری دیش حاوی سالین گذاشته شد. نخاع برای ادامه کار به مدت 25 دقیقه به دمای 20- انتقکا داده شکد. غلظکتمایکوباکتریوم موجود در ادجوانکت هکای کامکل فرونکد تجکاریmg/ml 2 اسکت ککه آن را بایکد حکداقل بکهmg/ml 2 رس اند .ادجوانت تغلیظ شده به نسبت 2:2 به نخاع اضافه شد و توسط هموژنایزر به مدت 10 دقیقه با همدیگر مخلوط شدند. سکپساین ترکیب به هر مو به صورت زیرجلدی به میکزانml 4/0 تزری شد.
در مطالعککات انجککام گرفتککه از روشککهای متفککاوتی بککرایدرجهبندی شدت بیماری در EAE استفاده شده است. در همه این روشها، درجه بیماری هریک از گروهها در آن روز، عبکارت است از میانگین شدت بیمکاری در تمکام موشکهایی ککه در آنگروه قرار دارند. عدم ابتلا به بیمکاری ) 0(، اخکتلا در حرککتدم )2(، فلج شدن دم )4(، اختلا در راه رفتن )1(، فلجی یک پا )2(، فلج هر دو پا )5(، فلج کامل دست و پا )6( و مرگ )0(. روز القا روز صفر در نظر گرفته میشود؛ سپس هکر روز موشکهابه دقت توزین شده و علائم کلینیکی آنها ثبت میشود. علائکمبیماری از روز نهم مشاهده شد؛ که اولین علائم بکا اخکتلا درحرکت دم و فلج شدن دم همکراه اسکت. اجکازه داده شکد ککهعلائم کلینیکی در اکثریت مو ها مشکاهده شکود؛ سکپس 10 سر مو در سه گروه جای داده شدند:
-گروه شم: گروهی که در آنها بیمکاری القکا شک د؛ علائکم هکمظاهر شد ولی تنها سالین دریافت کردند.
-گروه تجربی او : گروهی که در آنها بیماری القکا شکد و بکهم دت 20 روز ml 4/0 محل و زه ر زنب ور محل و در نرم ا سالین با غلظکتmg/kg 2 بکه صکورت درون صکفاقی دریافکتنمودند.
– گروه تجربی دوم: گروهی که در آنها بیماری القا شکد؛ پکساز ظهور علائم به مدت 20 روز با ml 2/0 زهر زنبور محلو در نرما سالین با غلظت mg/kg 4 به صورت درون صفاقی تیمکارشدند.
گروه کنتر : گروهی که القا نشدند و تفاوت آنها با گروه او این است که سالین دریافت نکردند.
تمامی گروهها به طور روزانه طی 20 روز القا، تکوزین شکده و با هم مقایسه شدند. روز القا روز صفر در نظر گرفته شد.

بررسي سطح 6IL در سرم خون به روش الايزا
در روز بیست و یککم پکس از القکا حیوانکات بکا هیدروکلریکدکتککک امین) mg/kg 240-200( و هیدروکلریککک د گککک زیلن )mg/kg 42( بیهو شکده و از قلکب آنهکا خکون گرفتکه شکد.نمونههای خکونی گرفتکه شکده در دسکتگاه سکانتریفوژ بکا دور4500 دور در دقیقه قرار داده شد تکا سکرم آن بکرای تکنیککایی زا ج دا ش ود .از ای ن تکنی ک ب ه منظ ور تعی ین س طح سیتوکاین 6IL در سرم و در نتیجه تعیین شاخ بکرای پاسکخمسیر 1Th استفاده شد. در این مطالعه از کیت اییزا بکا شکمارهکاتالوگ DY506 برای اندازهگیری سطح سرمی اینترلکوکین 6 و مطاب باپروتوکل شرکت سازنده استفاده گردید. در سکنجشفو که از نوع ساندویجی آویدین بیوتین میباشد، آنتکی بکادیضد 6IL کف پلیت کوت مکی شکود و پکس از بلاکینکگ توسکط
)BSA) Bovin Serum Albumin، اسکتانداردهای مربکوط ب هکیت اضافه میشود؛ در مرحله بعد آنتیبادی بیوتینه ضکد 6IL و در نهای ت محل و اس ترپتوآویدین متص ل ب ه HRP اض افه میشود و پس از مراحل شستشو و افکزودن سوبسکترا واککنشرنگی ایجاد میشود. نتایج در طو مکوج 250 نکانومتر توسکطنتایج در طو موج 250 نانومتر توسط ELISA reader خوانده
02
شد. نتایج بعد از تهیه نمودار اسکتاندارد، بکرای تعیکین غلظکتسیتوکاین در هر یک از چاهکها مورد ارزیابی قرار گرفت.

بررسيهای بافتي
برای بررسی بافتی، مغزها پکس از خکارج نمکودن از جمجمکهبرای ادامکه ککار و مراحکل آمکادهسکازی و برشکهای بکافتی بکهفالکونهای حاوی فرمالین 20% انتقا داده شدند. نمونههکا بکاتیغ بیسوری به برشهای 1-4 میلیمتکری در مقکاطع مختلکفتقسیم و شمارهگذاری شدند .سپس نمونههکا در دسکتگاه T.P )tissue processor( قرار داده شکدند . ایکن دسکتگاه بکهترتیکبنمونهها را در محلولهای فرمکالین، الککل رقیک ، الککل غلکیظ،گزیلل و پارافین مذاب غوطکه ور مکی کنکد. سکپس نمونکه هکا ازپارافین مذاب خارج گشته و در قالبهای آلومینیومی قکرار دادهشدند و با پارافین قالبگیری گشتند. پس از آن بکا اسکتفاده ازدس تگاه میکروت وم قالبه ای پ ارافینی ب ر داده ش دند ک ه ضخامت این برشها بین 2-1 میکرون است. یمها ابتدا در فکور00-60 درجه و سپس در گزیلکل قکرار داده شکدند تکا بقایکایپارافین خارج شود. سپس یمها در الککل قکرار داده شکدند تکاگزیلل از روی یم پاک شود. به منظور رنگآمیزی، یمها ابتکدابا رنگ هماتوکسیلین، و پس از شستشو با ائوزین رنگ شدند.

آناليز آماری
برای تجزیه و تحلیل آماری جهکت مقایسکه دادههکای گکروهکنتر ، شکم و تجربکی از نکرم افکزار SPSS17 و آزمکون آمکاری one-way ANOVA اسکتفاده شکد و مقکادیرp کمتکر از 05/0 معنیدار تلقی شد. سپس نمودارهای مربوطه بوسیله نکرم افکزارEXCEL رسم گردید.

يافتهها
بررسي شدت بيماری در گروههای مختلف
رتهای لوئیس ایمیونیزه شده با ترکیب نخاع خوکچه هندی و ادجوانت کامل فروند در مکد EAE، التهکاب و علائکم اولیکهکلینیکی را نشان دادند. شروع علائم بیماری در روز نهکم پکساز القا بود که با اختلا در حرککت دم آغکاز شکد. در روزهکای21 -24 پس از القا )1 تا 2 روز از شکروع علائکم( اوج بیمکاریمشاهده شد که در این زمان موشکها از هکر دو پکا فلکج شکدند.
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

رتهککای مککورد اسککتفاده وزنg 40±200 داشککتند. یکککی از شاخصهای این بیماری کاهش وزن میباشد که تکوزین روزانکهآنها نشان داد که وزن اکثریت موشها پس از القا نسبتاً ککاهشیافت. گروه کنتر هیچیکک از علائکم بیمکاری را نشکان نکداد.رتهای گروه شم نسبت به سایر گروههکای تیمکار در مراحکل
04
بایتری از بیماری قرار داشتند و همچنین مدت زمان بیشتری از بیماری را نشان میدادند. ایکن در حکالی بکود ککه حیوانکاتگروه تجربی دوم در مراحل بسیار پایین بیمکاری بکاقی ماندنکد )نمودار 2(

نتايج حاصل از توزين رتهای القا شده و درمان شردهبا BV:
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

نمودار توزین رتها در روزهای تیمار در نمودار 4 نشکان دادهشده است. از روز نهم پس از القا رتها وارد فاز بیماری شکدند،گروه کنتر )گروهکی ککه دسکت نخکورده بکاقی ماندنکد( وزن طبیعی خود را حفظ کردند. گروه شم )که بیماری در آنها القکا شد، اما تنها نرمکا سکالین دریافکت کردنکد( کمتکرین وزن راداشتند. در حالی که گروههای تحت تیمکار بکاBV نسکبت بکهگ روه ش م اف زایش وزن را نش ان دادن د. در می ان گروهه ای تجربککی، گککروه تجربککی دوم کککه غلظککتmg/kg 4 از BV را دریافت کرده بود، نسبت به گروه شم و گکروه تجربکی او وزنبیشتری را نشان داد که نشاندهنده وابسته بکه دوز بکودن اثکرBV میباشد.

بررسيهای هيستولوژيك
پس از آمادهسازی بافتی و تهیکه برشکهای میکروسککوپی بکهضک خامت 2-1 میکک رون از مغک ز، رنک گآمیک زی بک ه رو هماتوکسیلین و ائوزین انجام شد. بررسی بخش عصکبی نشکانداد که با القا بیماری، التهاب و دمیلینه شدن دیده مکی شکود وبا پیشرفت بیماری، این دمیلینه شکدن بخکش بیشکتری را بکهخود اختصاص میدهد. این در حالی بود ککه ف رآینکد رمیلینکهشدن در گروههای تحت تیمار با BV مشاهده شد )شکل 2(.

نمودار 2. نمودار شدت علائم کلینیکی برحسب روزهای پیگیری و به تفکیک گروههای مورد مطالعه شامل گروه تجربی او )1exp، القاء و تحت درمان باmg/kg 2 زهرزنبور(، گروه تجربی دوم )2exp، القاء و تحت درمان باmg/kg 4 زهر زنبور(، گروه شم و گروه کنتر . گروه شم نسبت به سایر گروههای تیمار مرحله بایتر بیماری و مدت زمان بیشتری از بیماری را نشان میدهد. گروه تجربی دوم نیز در مراحل بسیار پایین بیماری باقی ماند. Mean±SD

نمودار 4. مقایسه وزن حیوانات برحسب گرم و بر اساس روزهای پیگیری به تفکیک گروههای مورد مطالعه شامل گروه کنتر ، گروه تیمار شده با زهر زنبور، گروه تجربی او )القاء و تحت درمان باmg/kg 2 زهرزنبور(، گروه تجربی دوم )القاء و تحت درمان باmg/kg 4 زهر زنبور(. گروه شم )القا بیماری و دریافت نرما سالین( کمترین وزن را داشتند، در حالیکه تیمار با زهر زنبور از کاهش وزن رتها جلوگیری نمود، به طوری که گروه تجربی دوم نسبت به گروه تجربی او و گروه شم وزن بیشتری را نشان دادند. Mean±SD
01

نتايج حاصل از بررسي سطح 6IL به روش الايزا
بررسی مقایسهای سطح سرمی سیتوکاین پیشالتهابی 6IL به 6IL درگروه تیمار دوم کاهش بیشتری را نشان میدهکد و ایکنرو ایی زا در گروهه ای مختل ف کنت ر ، ش م و همچن ین نتایج نشان داد که تیمار با زهر زنبور به صورت وابسته بکه دوزگروههای تیمار شده با BV در نمودار 1 نشان داده شده است. باعث کاهش سطح این مارکر میشود.

شکل 2: فتو میکروگراف رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین از بافت مغز .A: گروه کنتر )بدون القا(. B: گروه شم .C: گروه بیمار تیمار شده با mg/kg 2 زهر زنبور، D: گروه بیمار تیمار شده با mg/kg 4 زهر زنبور. پیکان بخشهای میلینی را نشان میدهد. همانطور که در شکل نشان داده شده است، در گروه شم میزان میلین به شدت کاهش یافته است، در حالی که پس از تیمار با زهرزنبور میزان رمیلینه شدن افزایش یافته است.
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:09 +0330 on Wednesday January 10th 2018

**
*
.0000
50.0000
100.0000
150.0000
200.0000
250.0000
control
sham
exp1
exp2

اینترلوکین

سرمی
سطح

6
control
sham
exp1
exp2



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید