پژوهنده (مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي)
سال هفدهم، شماره 4مهر ، و پي آباندر پي 1391 88، صفحات 210 تا 214 تاريخ تاريخ پذيرش دريافت مقاله:مقاله : 30/21/6/10/13911391
تشخيص و بررسي مقاومت آنتي بيوتيكي باكتري اشريشياكلي O157 جدا شده
از گوشت قرقاول، كبك، اردك و غاز
سميرا عباسي*1، دكتر حسن ممتاز2، دكتر ابراهيم رحيمي3، منوچهر مؤمني4، مجيد رياحي4

عضو انجمن علمي علوم و صنايع غذايي، دانشكده كشاورزي، دانشگاه آزاد اسلامي، واحد شهركرد
دانشيار گروه ميكروبيولوژي، دانشكده دامپزشكي، دانشگاه آزاد اسلامي، واحد شهركرد
دانشيار گروه بهداشت مواد غذايي، دانشكده دامپزشكي، دانشگاه آزاد اسلامي، واحد شهركرد
-10922208258

كارشناس مركز بيوتكنولوژي، دانشگاه آزاد اسلامي واحد شهركرد چكيده
سابقه و هدف: با وجود ارزش بالاي گوشت طيور، كنترل و بازرسي دقيقي بر روي لاشه هاي ذبح شـده طيـور در كشـتارگاهها صـورتنمي گيرد. در نتيجه امكان انتقال برخي از باكتري ها مانند اشريشياكلي كه يكي از عمده ترين باكتري هـاي ايجـاد كننـده فسـاد غـذايياست، به انسان وجود دارد. اين بررسي به منظور تشخيص و بررسي الگوي مقاومت آنتي بيوتيكي باكتري اشريشياكلي O157 جـدا شـدهاز گوشت قرقاول، كبك، اردك و غاز در استانهاي گيلان، مازندران، اصفهان و فارس انجام شد.
مواد و روشها: براي انجام اين بررسي به ترتيب تعداد 25، 17، 22 و 36 نمونـه گوشـت عضـله سـينه قرقـاول، كبـك، اردك و غـاز ازاستانهاي ذكر شده جمع آوري شد و در يخچال حاوي يخ سريعاً به آزمايشگاه انتقال داده شد. نمونه ها ابتدا كشت داده شدند و سپس از كلني هاي تيپيك كه نشانگر اشريشياكلي بودند ،DNA استخراج گرديد و واكنش زنجيره اي پليمراز بـراي تأييـد تشـخيص و شناسـاييگروه سرمي O157 استفاده شد. در پايان الگوي مقاومت آنتي بيوتيكي به روش ديسك گذاري ساده مورد بررسي قرار گرفت.
يافته ها: نتايج نشان داد كه 27% نمونه ها از نظر وجود اشريشياكلي مثبـت بودنـد كـه 6 نمونـه آن داراي گـروه سـرميO157 بودنـد.بررسيها نشان داد كه بيشترين و كمترين فراواني باكتري و گروه سرمي O157 به ترتيب متعلق به گوشـت غـاز و گوشـت كبـك بـودهاست. باكتري اشريشياكلي جدا شده از گوشت طيور، بيشترين ميزان مقاومت آنتـي بيـوتيكي را بـه سولفامتوكسـازول و ونكومايسـين وكمترين ميزان مقاومت آنتي بيوتيكي را به جنتامايسين و سيپروفلوكساسين داشته اسـت. اخـتلاف آمـاري معنـي داري (05/0P<) بـينميزان شيوع باكتري و گروه سرمي O157 بين گوشت غاز و كبك و همچنين بين ميزان مقاومت به آنتي بيوتيك هاي مختلف ديده شد.
نتيجه گيري: پيشنهاد مي شود كه از روش دقيق، سريع و بي خطر واكنش زنجيره اي پليمراز به منظور كنترل بهداشت گوشـت طيـور ازنظر وجود پاتوژن هايي مثل اشريشياكلي بهره گيري شود. اين بررسي نشان مي دهد كه اسـتفاده از روش ديسـك گـذاري سـاده قبـل ازتجويز آنتي بيوتيك بسيار ضروري است.

6109232318

واژگان كليدي: اشريشياكلي O157، مقاومت دارويي ميكروبيال، گوشت طيور، واكنش زنجيره اي پليمراز لطفاً به اين مقاله به صورت زير استناد نماييد:
510312251

Abbasi S, Momtaz H, Rahimi E, Momeni M, Riahi M. Detection and assessment of antimicrobial resistance properties in Escherichia coli O157 isolated from pheasant, partridge, duck and goose meat. Pejouhandeh 2012;17(4):210-14.

0مقدمهF1
گوشت طيور يكي از اصلي ترين غذاهاي مردم ايران به شـمارمي رود. گوشت طيـور از نظـر تغذيـه انسـاني منبـع مناسـب و خوبي از لحاظ آهن، فسفر، پـروتئين و ويتـامينD محسـوب مي شود. اين گوشت از نظر پروتئين و اسيدهاي آمينه ضروري

*نويسنده مسؤول مكاتبات: سميرا عباسي؛ شهركرد، دانشگاه آزاد اسـلامي دانشـكدهكشاورزي، صندوق پستي 166؛ پست الكترونيك: [email protected]

نسبت به گوشتهاي ديگر كمبودي نـدارد . متأسـفانه بـا وجـودكليه ويژگيهاي مطلوبي كه اين گوشت را برجسـته مـي سـازد،كنترل و بازرسي لازم در كشتارگاههاي طيور انجام نمـي شـود.در نتيجه گوشت طيور مي تواند منبع مناسـبي بـراي تكثيـر ورشد باكتري هـاي متفـاوت باشـد. مطالعـات نشـان داده اسـتباكتري اشريشياكلي به راحتي مي تواند موجـب فسـاد گوشـتطيور شود( 1 و 2).
اشريشياكلي يك باكتري گرم منفـي، ميلـه اي شـكل، بـدوناسپور و بي هوازي اختياري است كه جزو بـاكتري هـاي روده اي بوده و موجب مسموميت غذايي مهلك در انسان مي گردد. اين باكتري به چندين تيپ متفاوت تقسيم مي شود كه عبارتنـد از : اشريشـياكلي توكسـ ين زاي روده اي( ETEC)، اشريشـياكلي خــونريزي دهنــده روده اي( EHEC)، اشريشــياكلي پــاتوژني روده اي( EPEC)، اشريشياكلي متهـاجم روده اي( EIEC) و در نهايــت اشريشــياكلي چســبنده روده اي( EAEC) (3). تيــپ EHEC شامل يك تحت تيپ مهم به نام اشريشياكلي توليـدگرشيگاتوكسين( STEC) مي شود كه تحقيقات نشان داده اسـتاين تيـپ عامـل ايجـاد دو بيمـاري مهـم و خطرنـاك كوليـتخونريزي دهنده و سندرم هموليتيك اورميـك اسـت (4 و 5).
در مطالعات بسياري نيز، گـروه سـرميO157 از گوشـت مـرغجداسازي شده است( 1 و 2). در تمام موارد بيماريهايي كه در اثر اين باكتري ايجاد مي شوند، درمـان آنتـي بيـوتيكي بهتـريناقدام جهت بهبودي و كنترل بيماري است، اما متأسفانه امروزه مقاومــت آنتــي بيــوتيكي بســيار شــديدي در برابــر بــاكترياشريشياكلي ايجاد شده است( 6). تحقيقات نشان مي دهد كـهدر برخي كشورها مصرف ساليانه آنتي بيوتيك در مزارع پرورش طيور به 300000 كيلوگرم نيز مي رسد( 7). در نتيجه مصـرفزياد و بي رويه آنتي بيوتيك، سبب بروز مقاومت آنتـي بيـوتيكيشديدي در اكثر باكتري ها شده است .
متأسفانه عليرغم اهميت بالاي طيور در كشور ايران، تا كنون هيچ مطالعه اي در مورد ميزان شيوع و مقاومت آنتـي بيـوتيكيباكتري اشريشياكلي انجام نگرفته است. در نتيجه اين مطالعـهبه منظور بررسي ميزان شيوع باكتري اشرشياكلي، گروه سرمي O157 و همچنين بررسي مقاومـت آنتـي بيـوتيكي ايـن گـروهسرمي جدا شده از نمونه هاي گوشـت قرقـاول، كبـك، اردك وغاز، از ارديبهشت تا مرداد ماه 1391 انجام گرفته است.

مواد و روشها
تحقيق حاضر به روش توصيفي انجام گرفت. براي ايـن منظـور25 نمونه گوشت قرقاول ،17 نمونـه گوشـت كبـك، 22 نمونـهگوشت اردك و 36 نمونه گوشت غاز از مراكـز فـروش گوشـت ومواد پروتئيني استانهاي گيلان، مازندران، اصـفهان و فـارس بـهطور تصادفي انتخاب گرديد. قبل از نمونه گيري به منظور از بـينبردن آلودگي سطحي، سطح گوشت بـا الكـل 70% ضـد عفـونيشد. كليه نمونه ها از گوشت عضله سينه طيـور گرفتـه شـد و دريخچال حاوي يخ سريعاً به مركز تحقيقات بيوتكنولوژي دانشـگاهآزاد اسلامي واحد شهركرد انتقال داده شد.
شماره 4، پي در پي 88، مهر و آبان 1391 سميرا عباسي و همكاران/ 211
در ابتدا سطح عضله سينه با آنس داغ و استريل ضـد عفـونيشد و از عمق عضله براي كشت در محيط MacConkey agar (Merck, Germany) استفاده شد. محيطهـا بـه مـدت 18-24 ساعت در دماي 37 درجه گرمخانه گذاري شـدند. كلنـي هـايتيپيك رشد كرده كه داراي خصوصيات ظـاهرياشريشـياكلي بودند، با آنس استريل برداشته شده و دوبـاره در محـيط آگـارخوندار كشت و گرمخانه گذاري شدند و در نهايـت بـه محـيط
EMB agar (Merck, Germany) انتفال يافتند. كلني هاي سبز متاليك رشد كرده در محـيطEMB agar بـه عنـوان بـاكترياشريشــياكلي تيپيــك مــورد پــذيرش قــرار گرفتنــد. كليــه اشريشياكليهاي جدا شده در دماي 70- درجـه سـانتيگراد درگليسرول نگهداري شـدند( 8). بـه منظـور تأييـد تشـخيص ازروش واكنش زنجيره اي پليمراز( PCR) استفاده گرديـد. بـدينمنظور از روش Sabat و همكاران( 9) استفاده شد.

استخراج DNA
باكتري هاي رشد كرده در طول يك شـب در محـيطLuria- Bertani broth (Merck, Germany) گرمخانه گذاري شـدند وDNA ژنومي به وسيله كيت استخراج DNA شـركت سـيناژن(Purification DNPTM KIT DNA) و با توجه به دستورالعمل شركت سازنده استخراج شد و تا زمـان انجـامPCR در فريـزر20- درجه سانتيگراد نگهداري گرديد.

تشخيص گروه سرمي O157
ب ه منظ ور تش خيص ژن wzx گ روه س رمي O157، ت والي پرايمرهاي استفاده شده( 10)، به صورت زير بود:
WZX-F: 5′- CGG ACA TCC ATG TGA TAT GG-3′ WZX-R: 5′- TTG CCT ATG TAC AGC TAA TCC-3′ براي انجام واكنش PCR، حجم نهايي واكنش 25 ميكروليتـرب ود ك ه ش امل: 200 ن انوگرم DNA الگ و ،5/1 ميل ي م ولار 2MgCl، 5/0 ميكرومول از هر پرايمر ،25/1 واحد آنزيم DNA پليمراز Taq و200 ميكرو مولار dNTP Mix بود. بـراي انجـامواكـــنش PCR از دســـتگاه مسترســـايكلرگرادينت شـــركتEppendorf استفاده شد. برنامه حرارتي مورد اسـتفاده شـامل:
95 درجه سانتي گراد 3 دقيقـه، سـپس 30 چرخـه دمـايي بـهترتيب 95 درجه سانتي گراد 20 ثانيه، 58 درجـه سـانتي گـراد40 ثانيه و 72 درجه سانتي گراد 30 ثانيه و يك مرحله نهـايي
72 درجه سانتي گراد 8 دقيقه تنظيم گرديد. محصـولاتPCR بر روي ژل آگارز 5/1% الكتروفورز شدند، سپس ژل هـا توسـطاتيديوم برمايد رنگ آميزي شده و نوارهاي DNA با اسـتفاده ازپرتو UV مشاهده و ارزيابي گرديدند.
بررسي مقاومت آنتي بيوتيكي
به منظور بررسي مقاومت آنتي بيوتيكي باكتري اشريشـياكلي O157 جـدا ش ده از گوش ت طيـور مختل ف، از روش ديس كگذاري در محيط مولر هينتون آگار (HiMedia Laboratories, Mumbai, India, MV1084) و بـ ا توجـ ه بــه پروتكـ لآزمايشگاهي و باليني، استفاده شـد. پـس از گرمخانـه گـذاريهوازي در 37 درجه سانتي گـراد بـه مـدت 24-18 سـاعت درمحيط آزمايشگاه، الگوي مقاومت آنتي بيوتيكي بـاكتري هـا بـه وسيله روش طراحي شده توسط انستيتو آزمايشگاهي و باليني اســتاندارد، مــورد بررســي قــرار گرفــت( 11). از بــاكتري
اشريشياكلي ATCC 25922 ب ه منظ ور كنت رل در بررس ي مقاومت آنتي بيوتيكي استفاده شد.

بررسي آماري
به منظور انجام بررسي آماري از نرم افزار آماري SPSS شماره 16 و تست كاي دو استفاده گرديد. در اين بررسـي 05/0 < P به عنوان سطح معني داري معرفي شد.

يافته ها
212/ دوماهنامه پژوهنده تشخيص و بررسي مقاومت آنتي بيوتيكي باكتري اشريشياكلي …
در اين بررسي از تعداد 100 نمونه گوشت طيور مختلف، 27 نمونه (27%) از نظر وجود اشريشياكلي، مثبـت بودنـد. پـس ازاستفاده از پرايمرهاي اختصاصي جهت تشخيص گـروه سـرمي O157 در گوشت طيور، مشخص شد كه از 27 نمونه مثبت ،6 نمونه( 2/22%)، آلوده به گروه سرمي O157 بـوده انـد. در ايـنميان، ميزان شيوع باكتري اشريشياكلي و گـروه سـرمي O157 در گوشت غاز بيشترين فراوانـي و در گوشـت كبـك كمتـرينفراواني را داشت .بررسيهاي آماري نشانگر وجود اختلاف آماري معني داري بين ميزان شيوع باكتري در غاز و كبك بوده اسـت.همچنين ميزان حضـور گـروه سـرميO157 در كبـك و غـازداراي اختلاف آماري معني داري بود. توزيـع نمونـه هـاي مـوردبررسي بر حسب موارد مثبت اشريشياكلي و موارد مثبت گـروهسرمي O157 در جدول شماره 1 ارائه شده است.

جدول 1- فراواني آلودگي به اشريشياكلي و گروه سرمي O157 در گوشت پرندگان مورد مطالعه
تعداد مثبت گروه سرمي O157 تعداد مثبت اشريشياكلي تعداد نمونه
2 8 25 قرقاول
0 3 17 كبك
1 7 22 اردك
3 9 36 غاز
6 27 100 كل

نتايج بررسي الگوي مقاومت آنتي بيوتيكي در جدول شماره 2 ارائه گرديده و نشان مي دهد كه باكتري اشريشياكلي جدا شده از گوشت طيور بيشترين مقاومت آنتي بيوتيكي را به ونكومايسين و سولفامتوكسازول داشته است و هيچگونه مقاومت آنتي بيوتيكي در برابر جنتامايسين و سيپروفلوكساسين مشاهده نشد. از طرفي بيشترين مقاومت آنتي بيوتيكي را باكتري هاي جدا شده از گوشت غاز و كمترين مقاومت آنتي بيوتيكي را باكتري هاي جدا شده از كبك داشتند. گوشت غاز نه تنها بيشتر توسط باكتري اشريشياكلي آلوده بود، بلكه ميزان حضور گروه سرمي O157 در آن هم بيشتر بود؛ همچنين مقاومت آنتي بيوتيكي در باكتري هاي جدا شده از آن نيز بيشتر بود. اين بررسي نشان داد كه باكتري اشريشياكلي O157 داراي مقاومت آنتي بيوتيكي بالايي نسبت به اكثر آنتي بيوتيك هاي معمول است. در اين بررسي، اختلاف آماري آشكاري بين ميزان مقاومت به سولفامتوكسازول با جنتامايسين و سيپروفلوكساسين (05/0 P<) ديده شد.
جدول 2- الگوي مقاومت ضد ميكروبي در باكتري اشريشياكلي جدا شده از گوشت پرندگان

مثبت

تعداد
اشريشياكلي

در

هر
گونه

آنتي

مقاومت

ميزان

بيوتيكي

سيپروفلوكساسين

سفازولين

اريترومايسين

ونكومايسين

سولفامتوكسازول

تتراسيكلين

سفالكسين

فلومكوئين

جنتامايسين

مثبت

تعداد

اشريشياكلي

در

هر



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید