پژوهن ده (سال شانزمجلهدهم ، شمارهمرداد پژوهشي 3و، پي شهريدردانشگاه ور پي علوم 139081، پزشكي صفحات شهيد125 تا 129بهشتي ) تاريختاريخ پذيرشدريافت مقالهمقاله:: 2211/5//3/13891390

مقايسه تنظيم بيان پروتئين آكواپورين1- طي تكوين مغز
در رت هاي نژاد ويستار و H-Tx
دكتر محمد نبيوني1*، جواد رسولي2، آذر شيخ الاسلامي3

استاديار، گروه زيست شناسي، دانشكده علوم پايه، دانشگاه تربيت معلم، تهران
كارشناسي ارشد تكوين جانوري، گروه زيست شناسي، دانشكده علوم دانشگاه تربيت معلم، تهران
دانشجوي دكتري رشته تكوين جانوري، گروه زيست شناسي، دانشكده علوم پايه، دانشگاه تربيت معلم، تهران

چكيده
سابقه و هدف: در هيدروسفالي مادرزادي تجمـع بـيش از حـد مـايع مغـزي نخـاعي در مغـز باعـث تغييـر منفـي درهومئوسـتاز آب مي گردد.AQP) Aquaporin ) خانواده اي از پروتئين هاي كانالي آبي عرض غشايي مي باشـند كـه نقـش مهمـي را در تكـوين مغـز ايفـا مي كنند و احتمالاً در ايجاد هيدروسفالي مادرزادي نيز نقش دارند.
مـواد و روشـها: در ايـن مطالع ه ميـزان بيـان پـروتئين AQP-1 در رت نـژاد Hydrocephalus Texas (H-Tx) توسـط روشـهاي ايمونوهيستوشيمي، وسترن بلات و الايزا بررسي گرديد. هيدروسفالي در اين حيوانات در نتيجه انسداد قنات مغـزي در روز 18 جنينـيرخ ميدهد كه اين شرايط در هفته هاي 4-5 كشنده است. ميزان بيان پروتئينAQP-1 در رت هايH-Tx غيرمبتلا و مبتلا و رت هـايكنترل Wistar در روزهاي جنيني 17 و 19 و همچنين در سنين بعد از تولد P3 و P10 ارزيابي گرديد.
يافته ها: سطح بيانAQP-1 در رتهايH-Tx مادرزادي و مبتلا در مقايسه با رتهاي كنترلWistar كـاهش يافـت. ايـن كـاهش در E17 يعني يك روز قبل از انسدادAqueduct در اين حيوان مدل رخ داد كه در رتهاي تازه متولد شـده ايـن كـاهش بيـان بيـشتر در نمونه هاي P10 مشاهده گرديد. اين مطلب پيشنهاد مي كند كه شكلگيري اين بيماري ميتواند پديده اي با اثرطولاني باشد.
نتيجهگيري: AQP-1 نقش مهمي را درتوليد CSF طي مراحل اوليه دوره حاملگي در هيدروسفالي مادرزادي ايفـا مـي كنـد. براسـاسشواهد مولكولي طي مراحل رشد و نمو در اين حيوانات مدل، نقص در تنظيم بيان پروتئين AQP-1 ميتواند در ايجاد اين بيماري نقش داشته باشد . مكانيسم عمل مستقيم پروتئينAQP-1 در مسير جريانCSF و يا اثر غير مستقيم آن بر تكوين مغز هنوز شـناخته شـدهنيست و نيازمند مطالعات بيشتر مي باشد.
واژگان كليدي: Aquaporin-1، هيدروسفالي مادرزادي، رت H-Tx، مايع مغزي نخاعي (CSF)

لطفاً به اين مقاله به صورت زير استناد نماييد:
Nabiuni M, Rasouli J, Sheikholeslami A. Comparative study of aquaporin-1 protein expression in developing brain of Wistar and H-Tx rats. Pejouhandeh .9-521:)3(61;1102

مقدمه1
هيدروسفالي بيماري است كه در نتيجه عدم توازن ميان ترشح و بازجذب مايع مغزي نخاعي ايجاد مي گردد. اين بيماري علائم كلينيكي متعددي را نشان مي دهد كه يك ويژگي متداول آن افزايش فشار داخل جمجمه اي مي باشد كه اگر درمان نگردد به اختلالات مغزي و ادراكي و نهايتاً مرگ منجر

* نويسنده مسؤول مكاتبات: دكتر محمد نبيون ي؛ تهران، خيابـان مفـتح، پـلاك
49، دانشگاه تربيـت معلـم، دانـشكده علـوم پايـه، گـروه زيـست شناسـي؛ پـستالكترونيك: [email protected]

مي گردد. هيدروسفالي مي تواند در هر سني رخ دهد، كه در اغلب موارد در كودكي قابل درمان ميباشد 1().
پروتئينهايAQP كانال هاي آب در غشاي سلول ميباشـند كه موجب افزايش نفوذپذيري به آب در سلول هـاي ترشـحي و جذب كننده مي گردند 2(). اعضاي خانواده AQP يك مجموعه متشكل از چهار زيرواحد يكسان ميباشند كه 60-25% تـواليپروتئيني آنها همسان مـيباشـد . هـر زيرواحـد آن از 6 قطعـهعرض غشايي با يك موتيف حفظ شده Asp-Pro-Val (NPA) كه منفذ عبور آب را ايجاد مي كنند تشكيل شده است 3(). 126AQP-1, 4, 9 در سيستم عصبي مركزي يافت مي شوند و در تنظيم ه ومئوستاز آب مغز نقش اصلي را ايفا مينمايند. AQP-1 يك پروتئين كاناليkDa 28 با نفوذپذيري دو طرفه بـه آبميباشد، كه اين پـروتئين در ترشـح و جـذب احتمـالي مـايعمغزي نخاعي نقش دارد (4).
AQP-1 بـه مقـدار زيـادي در غـشاي راسـي سـلولي شـبكه كوروييد و به مقدار كمتر در سلولهاي اپانديمي و هيپوكامپيبيان ميگردد، كه در ترشـح مـايع مغـزي نخـاعي از اپيتليـومشبكه ك وروييد دخالت ميكند. اخيراً نشان داده شده است كـهآنها در اندوتليوم ريزمويرگهاي مغز رت نيـز وجـود دارنـد 5(). مكانيسم هاي سيگنال دهـي درگيـر در تنظـيم بيـانAQP-1 پيچيده ميباشند و اطلاعـات مـا از آن بـسيار نـاچيز اسـت . از دست رفتن اين تنظيمات ميتواند بـه اخـتلالات نورولـوژيـكمتعددي منجر گردد، كه از آن جمله مي تـوان بـه ادم مغـزي،هيپرتانسيون درون جمجمـهاي، سـكته و هيدروسـفالي اشـارهنمود 6().
رتH-Tx (نژاد تگزاس ) حيوان مدل هيدروسفالي مادرزاديميباشد كه ابتدا از يك كلوني رت آلبينو حاصـل شـده اسـت. اي ن جه ش خ ود ب ه خ ودي در اي ن حيوان ات م دل از راه جفت گيري برادري خـواهري شـكل مـيگيـرد و در 53-23% زاده ها رخ مي دهد. انسداد قنات مغزي (Cerebral Aqueduct) در روز 18 جنيني رخ ميدهد و باعـث بـزرگ شـدگي بطنـيميگردد كه بطور فنوتيپي با برجستگي گنبدي شكل در ناحيهپشتي جمجمه قابل مشاهده ميباشد 7(). مغز اين حيوانات درمقايسه با رتهايWistar داراي مقـادير اضـافي از تجمـع آبمي باشد (8).
در ايــن تحقيــق مــدل H-Tx بــه دليــل وقــوع طبيعــيهيدروسفالي و همچنين شباهت زياد آن به نـوع هيدروسـفاليمادرزادي انساني به عنوان مدل مورد مطالعـه انتخـاب و مـوردبررسي و آزمايش قرار گرفت.

مواد و روشها
رتهاي نژاد ويـستار تهيـه شـده از مركـز تكثيـر و پـرورشحيوانات آزمايشگاهي دانشگاه تربيت معلم، و رتهاي نـژادH- Tx اهدايي دكتر جليل احمـد مايـان از دانـشگاه منچـستر، بـاشرايط 12 ساعت روشنايي و 12 ساعت تاريكي، و تغذيه و آب كافي نگهداري و پرورش داده شدند. بـه تولـههـاي رت اجـازهداده شد كه حداقل تا 21 روز از مادر تغذيه نمايند تا اينكه بـهسن مورد نظر براي انجام آزمايش برسند. سه گروه شامل گروه كنترل از رتهاي نژاد ويستار، گروه آزمـون از رتهـايH-Tx شامل نمونههاي نرمال (كه به عنوان نمونههاي گروه كنترل درنظر گرفته ميشوند) و نمونـههـايH-Tx هيدروسـفال(HC) براي آزمايشات درنظر گرفته شدند. موشهاي حامله و توله ها از هر دو گروه به روش استنشاق گاز 2CO كـش ته و مغزهـا بطـوركامل جداسازي شدند.
نمونـ ـه مغزهـ ـاي كامـ ـل در پارافرمالدهيــ د 4% درPBS (Phosphate Buffer Saline) با 3/7 pH: فيكس شدند. پس از 412- ساعت فيكس شـدن، نمونـههـا بـاPBS شستـشو داده شـدند و پـيش از غوطـهور شـدن در تركيـب (Sakura OCT Finetek Inc. Torrance, USA)، به مـدت 24-12 سـاعت در محلول سوكروز 20% قـرار داده شـدند و در ايزوپنتـان خنـكشده با يخ خـشك منجمـد شـدند. برشـهاي 10 ميكرومتـريCoronal ( از ميـ ان بطنهـ اي جـ انبي) توســط ميكروتـ وم كرايوستات تهيه گرديد و به منظور رنگ آميـزي و بررسـي بـرروي لام قرار گرفتنـد. نمونـه هـا در معـرض آ نتـيبـادي اوليـهمونوكلونــال (anti-AQP-1 مــوش؛ 1:500) انكوبــه شــدند.
پـس از شستـشو، نمونـههـا بـه (Serotec Ltd, Oxford, UK) horse مدت 2 ساعت در معرض آنتيبادي ثانويه بيوتينه شده(Vector Laboratories, قرار گرفتند anti-rabbit anti-mouse
Inc. Burlingame, CA, USA) پــروتئينAQP-1 توســط اويدين- بيوتين – پروكسيدازي دي آمينوبنزيدين رنگ آميـزي(Vector Elite ABC kits Burlingame, USA) گرديــد. بررسيهاي ايمونوهيستوشيمي در هر سه نمونه جـانوري انجـامشد.
،HC نمون ه مغزه اي كامـل پ س از جداسـازي از رت هـاي در (BioSpec, USA) Homogenizer توسط H-Tx و Wistar 1M Tris-HCl pH 8.0, 0.5M :شامل) Brij 150 بافر ليزكننده
(EDTA, 5M NaCl, 10% Brij 96, 10% NP 40 حل گرديد. محلول يك دست شده در g 14000 بـه مـدت 10 دقيقـه در دماي اتاق سانتريفوژ گرديد. محتو اي پروتئين كل توسط روشسنجش پروتئين برادفورد محاسبه گرديد.
µg 20 از محت واي پ روتئين ك ل توسـط ژل 10% SDS-PAGE در ولتاژV 100 به مدت يك ساعت جداسازي گرديـد
(Bio-Rad, Hercules, CA). پس از الكتروفـورز ، ژل بـه غـشانيتروسلولزي در ولتاژV 30 و دمـاي °C 4 انتقـال داده شـد. پس از انتقال، شستشوي غشاي نيتروسلولزي دو بار و هر بار به مدت 5 دقيقه توسط آب مقطر صورت گرفـت. غـشا بـر طبـق
روش western breeze chemiluminescent immunodetection به مدت 30 دقيقه در دمـاي اتـاق بلوكـهگرديد، سپس شستشو در دو نوبت 10 دقيقهاي انجام شد. عمل بلات ينـگ بـا اسـتفاده از آنتـي بـادي مونوكلونـال عليـهپروتئينAQP-1 (1:2000) انجام گرفت . در مرحله بعد 4 بـارشستشو انجام گرفـت و آنتـي بـادي ثانويـهanti mouse IgG اتصال يافته با اويدين- در سيستم آنزيمـي آلكـالاين فـسفاتازاضــافه گرديــد. بيــان AQP-1 توســطECL enhanced chemiluminescence شناسايي گرديد. بعد از شناسايي، غـشا ب ه مـدت 30 دقيقـه توس ط 10% SDS ،1M Tris–HCl و بتامركاپتواتـانول شست ـشو گرديـد. غ شا ب راي ي ـك س ـاعت درمعرض Sigma-Aldrich, 0.5 µg/ml) anti-β–actin) بعنوان كنترل قرار داده شد . در نهايت، نمونهها اسكن شده، در فرمـتJPEG عكسبرداري صورت گرفت.
محتواي كل پروتئين جدا شده از مغز كامل رت هـا (روزهـايجنيني 17 و 19 و همچنين در روزهاي و 3 10 بعـد از تولـد) به مدت 12 ساعت در دماي °C 4 و به مـدت يـك سـاعت دردماي محيط در پليت هـاي 96 تـايي(Costar, Corning Inc, NY, USA) انكوبه گرديد. پروتئين با غلظت µg/µl 200-25 به بافر چسباننده (كربنات سديم، بيكربنـات سـديم و سـديم آزايد درpH 6/9) اضافه شد . پـروتئين اسـتاندارد AQP-1 (بـاغلظتهاي ng200-50 در هر چاهك) به پليت ها اضافه و طـيش ب در دم اي °C 4 انكوب ه گردي ـد (هـر غلظـت سـه بـاراندازه گيري گرديد ). شستـشوي پليـتهـا توسـط آب مقطـر و TPBS انجام گرفت (سه مرتبه) و بلوكه شدن توسط BSA 3% درTPBS طي طول شب در دماي °C 4 انجام شد. شستشوي پليتها در سه نوبت صورت گرفت. سپس با پروكسيداز اتـصاليافته با anti-mouse IgG (به عنوان آنتيبادي ثانويـه ) انكوبـهگرديد. پس از آخرين دوره شستـشو، اضـافه كـردنABC بـهمدت 30 دقيقه و پس ازآن سوبستراي پروكسيداز (TMB kit
from Vector Laboratories) صورت گرفت. درنهايت، واكنش رنگ زا در طول موجهاي 630 و nm 405 توسط دستگاه پليت ريدر statfax 2100 بررسي گرديد.
يافته ها طي سه بار تكرار در هر نمونه به دست آمد و بصورتميـانگين همـراه انحـراف معيـار نـشان داده شـد. معنـي داري اختلافها با استفاده از آزمون تي مستقل و بـا در نظـر گـرفتن05/0< P بعنوان سطح معني داري اعلام گرديد.

يافته ها
در اي ن مطالع ه، بي ان پـروتئين AQP-1 مغ ز در رت ه اي H-Tx ،Wistar غيـــر مبـــتلا (نرمـــال) و HC (مبـــتلا بـــه هيدروسفالي) در سنين مختلـف انـدازهگيـري شـد . تغييـراتمغزي جنينهاي رت (E17 و E19) و همچنـين تولـه رتهـاي
بعــــد از تولــــد (P3 و P10) ازطريــــق تكنيــــكهــــاي ايمونوهيستوشيمي، وسترن بلاتينگ و الايزا مورد بررسي قـرارگرفتند.
نتــايج ايــن مطالعــه بــشدت كــاهش بيــانAQP-1 را در جنينهاي رت و توله ها در بعد از تولد نشان ميدهـد (رتهـايمبتلا و غير مبتلا با رتهاي كنترلWistar مقايـسه گرديـد).
اين يافتهها در رتهاي هيدروسفالP10 بارزتر ميباشـد . ايـنامر بيانگر اين مطلب است كه پديده غير طبيعـي بـودن بيـانپـروتئين AQP-1 در ايـن حيوانـات بـا افـزايش سـن در دوره جنيني و بعد از تولد با گذر زمان ادامه مي يابد.
رنگ آميزي ايمونوهيستوشيمي با استفاده از آنتي بادي مونوكلونال
عليهAQP-1 نشان داد كه اتصال آنتي بادي بـهAQP-1 در شـبكهكوروييــد جنينهــاي رت Wistar (روزهــاي 17 و 19) بيــشتر از نمونـه هـاي H-Tx صـورت گرفـت (شـكل 1). ايـن تفـاوت ميـان گروههاي حيواني هنگامي اهميت مييابد كه رتهـاي تـازه متولـدشده HC و Wistar در روزهايP3 و P10 مقايـسه گردنـد. جالـباينكه، رتهاي هيدروسفال بعـد از تولـد رنـگآميـزي آنتـيبـاديكمتري را نسبت به H-Tx هاي هم نژاد نشان دادند (شكل 2).
ايمونوبلات پروتئين كـل (تـام ) مغـز كامـل از جنينهـاي رتH-Tx ،Wistar وHC ، به روشني كـاهش بيـانAQP-1 را دررتهايH-Tx و HC در تمام سنين در مقايـسه بـا كنترلهـايWistar نشان داد (شكل 3). بنابراين، مـي تـوان نتيجـهگيـرينمود كه در اين مدل حيـواني كـاهش بيـانAQP-1 زودتـر ازانسداد Aqueduct (در روز 18 جنيني) رخ مي دهد.
اين كاهش بيان AQP-1 در هر دو مرحله جنينـي و پـس از
تولد در رت هاي HC و H-Tx در مقايسه با كنترلهـ اي Wistar با تكنيك الايزا نيز نشان داده شد (جدول 1 و 2). در اين مورد نيز كاهش بيانAQP-1 در مراحل رشد و نموي بعدي پررنگتر ديده مي شود (شكل 4).
جدول 1 – ميانگين و انحراف معيار ميزان جذب AQP-1 بدست آمده به روش الايزا در نمونه هاي Wistar و H-Tx در روزهاي 17 و 19 جنيني (E17, E19)
E19 E17 OD630nm/age
ميانگين انحراف معيار ميانگين انحراف معيار 1/395333 0/352429 1/340333 0/173708 Wistar
1/32 0/218687 1/065333 0/019348 H-Tx

126
جدول 2 – ميانگين و انحراف معيار ميزان جذب AQP-1 بدست آمده به روش الايزا در نمونه هاي H-Tx ،Wistar و HC در روزهاي و3 10 پس از تولد (P3, P10)
P3 P10 OD630nm/age
ميانگين انحراف معيار ميانگين انحراف معيار 1/593 0/095247 1/695333 0/114023 Wistar
1/241333 0/198561 1/017667 0/088059 H-Tx
1/223 0/226192 1/021333 0/034847 HC

شكل 1- رنگ آميزي ايمونوهيستوشيمي بافت شبكه كروئيد با آنتيبادي (a) :anti-AQP1 رت كنترل Wistar در H-Tx (b) ،E17 در Wistar (c) ،E17 در E19 و H-Tx (d) در E19 . پروتئين AQP-1 در نمونههاي (a,c) Wistar در مقايسه با نمونههاي (b,d) H-Tx بسيار بيشتر بيان شده است. پيكانها مناطقي را نشان مي دهند كه نسبت به AQP-1 مثبت ترند. غلظت آنتي بادي اوليه مورد استفاده 1:500 مي باشد. بزرگنمايي تصاوير: 400×

شكل 2- رنگ آميزي ايمونوهيستوشيمي بافت شبكه كروئيد با آنتي بادي عليه AQP-1 در: (a) رت Wistar در (b) ،P3 رت HC در (c) ،P3 رت Wistar در (d) ،P10 رت HC در P10. تراكم بيشتري در نمونه هاي (a,c) Wistar در مقايسه با (b,d) HC ديده مي شود، كه بيانگر كاهش معنيداري در ميزان بيان AQP-1 در حيوانات تأثير گرفته پس از تولد مي باشد. پيكانها مناطقي از لايه كروئيدي را نشان مي دهند كه نسبت به AQP-1 مثبت ترند. غلظت آنتي بادي اوليه مورد استفاده 1:500 و ثانويه 1:200 است. بزرگنمايي تصاوير: 400×

127

شكل 3 – بيان پروتئين AQP-1 در مغز كامل H-Tx مادرزادي و HC القا شده در سنين پيش و پس از تولد كاهش مي يابد. (A) ايمونوبلاتينگ نشان مي دهد كه H-Tx در E17 و E19 كاهش بيان پروتئين AQP-1 را در مقايسه با رتهاي كنترل Wistar دارد. AQP-1 (B) در رتهاي H-Tx و HC در روزهاي P3 و P10 پس از تولد در مقايسه با رتهاي كنترل Wistar كمتر بيان ميشود. اين كاهش بيان به نظر ميرسد در رت HC روز P10 آشكارتر است. در تصوير A و B، 20 ميكروگرم از كل پروتئين مغز كامل محلول از طريق SDS-PAGE جداسازي شده، بر روي غشاي نيتروسلولزي منتقل، و با anti-AQP1 IgG شناسايي شد. لكهها پاكسازي شد و آنتي بادي β-actin به عنوان كنترل بررسي شد.

شكل 4 – مقايسه قطعات پروتئيني مغز كامل پيش و پس از تولد بررسي شده با ELISA نشان مي دهد كه بيان AQP-1 در نمونه هاي Tx-H و HC در روز P10 كاهش داشته است. اين ميزان بيان در رت HC روز P10 در مقايسه با رت هاي كنترل (Wistar (W آشكارتر است. بررسيهاي آماري در گروههاي مختلفي انجام شد: بين رت Wistar روز E19 و Tx-H روز E19 (نمودار چپ)؛ بين رت Wistar روز P3 و رت HC روز P3، و رت Wistar روز P10 و رت HC روز P10 (نمودار راست). علامت ستاره 05/0 < P را نشان ميدهد.

بحث
هيدروسفالي بيماري مادامالعمر مي باشد كه تـا بـه امـروز، مسيرهاي درماني در بهبود قطعـي آن نـاتوان مانـده انـد . ايـنبيماري توسط عمل جراحـي و قـرار دادن شـانتSilastic بـهمنظور منحرف كردن مسير مـايع مغـزي نخـاعي تـا حـدوديدرمان ميگردد، امـا تـشخيص بـه موقـع و انجـام جراحـي درميزان موفقيت درمان بسيار مهم مـي باشـد 9(). ايـن تحقيـق براي اولين بار، ارتباط ميان AQP-1 و هيدروسفالي مادرزادي در مغز در حال تكوين رتهاي مدلH-Tx را در دوره جنيني نشان ميدهد.
آكواپورين ها پروتئين هاي كانال آبي انتخابي هستند كه نقشمركزي در هومئوستاز آب بدن انسان بازي مـي كننـد و شـبكه كوروييد بعنوان ساختار اصلي توليد مايع مغزي نخاعي در نظرگرفته ميشود. بيان انتخابيAQP1 بر سطح شـبكه كوروييـدنرمال انسان، نقش توليد مايع مغزي نخاعي توسط اين ساختارپيچيده را توضيح ميدهد (10). مورفولوژي شـبكه كوروييـد وموقعيت آن در ميان بطنهاي مغزي نـشان مـي دهـد كـه ايـنساختار مكان اصلي توليد مايع مغزي نخاعي است. كـاهش درنفوذپذيري اسمزي كه به دنبال نقـص در بيـانAQP1 ايجـادمي شود نشان ميدهد كـهAQP1 مـسير اصـلي بـراي انتقـالاسمزي آب در شبكه كروييد ميباشد، و در موشهاي بـا نقـصآكواپ ورين (AQP1-null)، ب ا م سيرهاي انتقـال آب ديگ ري جبران نمي شود (11).
128 RNA AQP-1 در روز 12 جنيني در رت بيـان مـيگـردد .
افزايش سطوح پـروتئينAQP-1 از روز 14 جنينـي مـشاهدهمي گردد كه در مراحل پس از تولد (در غشا ي قاعده اي جـانبيسلول هاي شبكه كوروييد) به تدريج افزايش مييابد (12). طي اين مطالعه مشاهده ميشود كه بيانAQP-1 در پيش از تولـدنيز رخ ميدهد.
شبكه كوروي يد كه جايگاه اوليـه بيـانAQP-1 مـيباشـد درترشح و بازجـذب احتمـالي مـايع مغـزي نخـاعي نقـش دارد.
سطوح بيـانAQP-1 در تومورهـاي شـبكه كوروييـد كـاهشمي يابد (13). جالب توجـه اينكـه پاپيلومـاي شـبكه كوروييـدالگوه اي ن اهمگوني از بي ان AQP-1 را ن شان م ي دهن د در حاليكـه ايـن امـر در كارسـينوماي بـدخيم شـبكه كوروييـد مشاهده نمي گردد. با توجه به اينكه اكثـر ايـن بيمـاران علائـمهيدروسفالي را نيز نشان ميدهند، الگوي بيـان AQP-1 را بـااين موضوع مرتبط ميدانند. هرگونه آسيب به هومئوستاز مايع مغزي نخاعي ميتواند به تغييـرات بيـان پـروتئين AQP-1 در هيدروسفالي و پاپيلوماي شبكه كوروييد منجر گردد (14).
مدل هيدروسفالي مـادرزادي كـه در ايـن مطالعـه اسـتفادهشده است آشكار ميسازد كه بيان كانالهايAQP-1 در مراحلبسيار ابتدايي رشد ونمو كاهش مييابد. ممكـن اسـت در ايـنحالت كا هش بازجـذب مـايع مغـزي نخـاعي از طريـق شـبكهكوروييد صورت گيرد. اين مكانيسم بازجذب موجب ورود مايع مغزي نخاعي به سيستم گردش خون ميگردد كه فقدان ايـنالگــوي بازجــذب در برخــي گونــههــا عامــل ايجــاد كننــدههيدروسفالي است (15). نتـايج حاصـل از مطالعـه مـا كـاهشوابـسته بـه سـن بيـان AQP-1 را در P3 تـا P10 و همچنـين بازجذب مايع مغـزي نخـاعي در شـبكه كوروييـد را پيـشنهادمي نمايد. ما در اين مطالعـه ، جنينهـاي پـيش از تولـد (E17 و E19) و رتهاي پس از تولد ( P3وP10 ) را به دليـل مـشابهتدوره هاي حاملگي و رشد و نموي با انسان انتخاب نموديم.
نتايج حاصـل از ايمونوهيـستوشيمي، ميـزان بـالاي اتـصالآنتي بادي عليهAQP-1 را در شبكه كوروييد رت هـاي كنتـرلWistar در مقايسه با حيوانـاتH-Tx مبـتلا نـشان مـي دهـد . بررسـ يهاي وسـ ترن بلاتينـ گ و الايـ زا نتـ ايج حاصـ ل از ايمونوهيستوشيمي را تأييد نمود . نتايج بدست آمده از وسـترنبلات نشان داد كـه بيـان پـروتئينAQP-1 در برشـهاي مغـزكامل رتهاي H-Tx و HC، بويژه در نمونههـايHC P10 بـهطور آشكاري كاهش يافت. اين كاهش بيان پـروتئينAQP-1 نشان مـيدهـد كـه بيمـاري هيدروسـفالي در حـال پيـشرفتمي باشد.
آنچه بايستي مورد توجه قرار گيـرد ايـن اسـت كـه تـشخيصبيماري هيدروسفالي در انسان در مراحل جنيني و حتي مراحـلاوليه پس از تولد كار آساني نيست؛ امـا در مـدل حيـواني مـوردمطالعه، علائمي نظير سـر گنبـدي شـكل، فنوتيـپ تغييريافتـهجمجمه، بزرگتر بودن سـر در دوره جنينـي و حتـي در مراحـلاوليه پس از تولد دلايلي مبني بر بيماري هيدروسفالي در حيوانميباشد. آنچنانكه Paul و همكـاران بـا مطالعـه رتهـايH-Tx پس از تولـد نـشان دادنـد كـه مـدل هيدروسـفالي در فنوتيـپظاهري حيوان نيز قابل تشخيص است (16). درحاليكه هدف درمطالعه حاضر، تـشخيص هيدروسـفالي در دوران جنينـي بـود وبنابراين مي بايست ماركرهايي ارزيابي مي شدند تـا بتـوان از رويتغييرات آنها هيدروسفالي مادرزادي را تشخيص داد.
در حقيقـتPaul و همكـاران نـشان دادنـد كـه ميـزان بيـانAQP-1 پس از تولد در رتهاي هيدروسـفال متغيـر اسـت و بـاگذشت زمان به حالت طبيعي نزديك ميشود (بررسـي روزهـاي5، 10 و 26 بعد از تولد). در حاليكه در مطالعـه حاضـر بررسـيداده هاي بدست آمده از ميـزان بيـانAQP-1 در روزهـاي 17 و19 جنيني، نشان ميدهند كه در رتهـاي كنتـرل ويـستار، در مقايسه با نمونههاي هيدروسفالي و غير مبـتلاي هـم نـژاد آنهـا، AQP-1 پيش از تولد نيز به ميزان بيشتري بيان ميشود.
اين مطالعه تغييرات بيان پـروتئينAQP-1 را طـي بيمـاريهيدروسفالي در اين مدل حيواني تصديق مينمايـد . هومئوسـتاز مايع مغزي نخاعي به اين كانالهاي آب وابسته ميباشـد و فـرضما بر اين اساس استوار است كـه كـاهش بيـانAQP-1 در ايـنحالت نقش اساسي را ايفا مي نمايد. با توجه به اينكه كاهش بيان پروتئينAQP-1 در روز 17 جنيني (E17) تـشخيص داده شـد (قبل از اينكه مجرايAqueduct مسدود گردد و قبـل از اينكـههيدروسفالي در ايـن مـدل حيـواني ايجـاد شـود) يـك فرآينـدژنتيكي را مي توان براي اين شرايط پيشنهاد نمود.

نتيجه گيري
نتايج نشان ميدهند كـه هنـوز مكانيـسم هـاي رشـد و نمـويناشناخته اي در اين حيوانات مبتلا به هيدروسفالي وجود دارد كـهدر آينده بايـستي مـشخص گردنـد. در ايـن زمينـه مـي بايـستيمطالعات بيشتري در سطوح ژني و رونويسي ژني صورت گيرد تـااين مكانيسم ها در سطوح بعد از رونويسي و بعد از ترجمه آشـكارگردند. به علاوه اين مطالعات اين اجازه را بـه مـا مـي دهنـد كـهدرك بهتري از هومئوستاز CSF در مغز داشته باشـيم. داده هـاييكه در اين تحقيـق مـورد بررسـي قـرار گرفـت توانـست ارتبـاطمنطقي را بين كانالهاي آبيAQP-1 و هيدروسفالي مادرزادي در رت مـدل H-Tx ايجـاد نمايـد. افـزايش بيـان پـروتئين AQP-1 مي تواند در حالت كنترل يا نبود هيدروسفالي مشاهده گردد.

تشكر و قدرداني
با توجه به انجام اين تحقيق در آزمايشگاه تحقيقـاتي سـلوليتكويني و مركز تكثير و پرورش حيوانات آزمايشگاهي دانـشگاه
129
تربيت معلم، بدينوسيله از مديريت محترم گروه زيست شناسيو دانشكده علوم دانشگاه تربيت معلم قدرداني نموده و از دكترجليل احمـد مايـان اسـتاد دانـشگاه منچـستر كـه در تـأميننمونه هـاي رت نـژادH-Tx مـا را يـاري نمودنـد سپاسـگزاريمي نماييم.
REFERENCES
120801067666

Philippon J. [“Normal pressure” hydrocephalus]. Psychol Neuropsychiatr Vieil 2005;3(1):53-61. (Full text in French)
Gunnarson E, Zelenina M., Aperia A. Regulation of brain aquaporins. Neuroscience 2004;129(4):947-55.
Verkman AS. Physiological importance of aquaporin water channels. Ann Med 2002;34(3):192-200.
Verkman AS. Physiological importance of aquaporins: lessons from knockout mice. Curr Opin Nephrol Hypertens 2000;9(5):517-22.
Dolman D, Drndarski S, Abbott NJ, Rattray M. Induction of aquaporin 1 but not aquaporin 4 messenger RNA in rat primary brain microvessel endothelial cells in culture. J Neurochem 2005;93(4):825-33.
Amiry-Moghaddam M, Ottersen OP. The molecular basis of water transport in the brain. Nat Rev Neurosci 2003;4(12):991-1001.
Kohn DF, Chinookoswong N, Chou S.M. A new model of congenital hydrocephalus in the rat. Acta Neuropathol 1981;54(3):211-8.
Cai X, McGraw G, Pattisapu JV, von Kalm L, Willingham S, Socci D, et al. Hydrocephalus in the H-Tx rat: a monogenic disease. Exp Neurol 2000;163(1):131-5.
Patwardhan RV, Nanda A. Implanted ventricular shunts in the United States: the billion-dollar-a-year cost of hydrocephalus treatment. Neurosurgery 2005;56(1):139-44.
Longatti PL, Basaldella L, Orvieto E, Fiorindi A, Carteri A. Choroid plexus and aquaporin-1: a novel explanation of cerebrospinal fluid production. Pediatr Neurosurg 2004;40(6):277-83.
Oshio K, Watanabe H, Song Y, Verkman AS, Manley GT. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. Faseb J 2005;19(1):76-8.
Johansson PA, Dziegielewska KM, Ek CJ, Habgood MD, Mollgard K, Potter A, et al. Aquaporin-1 in the choroid plexuses of developing mammalian brain. Cell Tissue Res 2005;322(3):353-64.
Longatti P, Basaldella L, Orvieto E, Dei Tos A, Martinuzzi A. Aquaporin(s) Expression in Choroid Plexus Tumours. Pediatr Neurosurg 2006;42(4):228-33.
Badaut J, Brunet JF, Grollimund L, Hamou MF, Magistretti PJ, Villemure JG, et al. Aquaporin 1 and aquaporin 4 expression in human brain after subarachnoid hemorrhage and in peritumoral tissue. Acta Neurochir Suppl 2003; 86: 495-
8.
Maurizi CP. The circulation and function of cerebrospinal fluid. Med Hypotheses 1984;15(2):155-62.
Paul L, Madan M, Rammling M, Chigurupati S, Chan SL, Pattisapu JV. Expression of Aquaporin 1 and 4 in a Congenital Hydrocephalus Rat Model. Neurosurgery 2011;68(2):462-73.



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید