پژوهنده (مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي) تاريخ دريافت مقاله: 24/4/88 سال پانزدهم، شماره 1، پي در پي 73، صفحات 31 تا 37 تاريخ پذيرش مقاله: 1/11/88 فروردين و ارديبهشت 1389

بررسي تكثير تكياخته كريپتوسپوريديوم در موشهاي Balb/c و C57bl/6 با
ايمني سركوب شده به منظور مدل سازي كريپتوسپوريديوزيس در نقص ايمني
دكتر حسين نهروانيان*1، ليلا عابدينزاده 2، دكتر كرم ا…قاسمي3، دكتر علي اسلاميفر4، دكتر سهيلا اژدري5، دكتر بهزاد اسفندياري6، دكتر صادق رهبري7، مرضيه عزتي ميرهاشمي6

دانشيار، گروه انگل شناسي، انستيتو پاستور ايران
كارشناس ارشد زيستشناسي، دانشگاه محقق اردبيلي
استاديار، دانشكده علوم، دانشگاه محقق اردبيلي
استاديار، بخش تحقيقات باليني، انستيتو پاستور ايران
استاديار، گروه ايمونولوژي، انستيتو پاستور ايران
محقق، انستيتو پاستور ايران
-9910204853

استاد، گروه انگلشناسي، دانشكده دامپزشكي، دانشگاه تهران چكيده
سابقه و هدف: كريپتوسپوريديوم يك انگل كوكسيديايي تكسلولي اجباري است كه باعث بيماري كريپتوسپوريديوزيس مـي شـود . بـاتوجه به وفور اين بيماري در مبتلايان به نقص ايمني و شيوع آن در مبتلايان به اسهال در ايران، اهميت اين انگل بيش از پيش آشـكار ميشود. بررسي اين بيماري در مدلهاي حيواني با ايمني سركوب شده ميتواند ما را در شناخت و كنترل آن ياري كند.
مواد و روش ها: نمونههاي مدفوع آلوده از انسان و دام جمعآوري شد. سپس ااسيستهاي آن جداسازي و با روش شناورسازي سوكروز تغليظ شدند. موشهاي Balb/c و C57bl/6 براي اين مطالعه در نظر گرفته شدند. دگزامتـازون بعنـوان داروي سـركوب كننـده ايمنـيبصورت داخل صفاقي تزريق شد و پس از تاييد سركوب ايمني بـا روش كشـت لنفوسـيتي، ااسيسـت هـاي كريپتوسـپوريديوم بصـورتخوراكي تلقيح شدند. پس از اثبات آلودگي، حيوانات را با روشهاي انساني كشته و اندامهاي هدف (كبد، طحال، ريه و روده) جداسازي و پس از تهيه برش و رنگآميزي بافتي به روش هماتوكسيلين ائوزين جهت مطالعات هيستوپاتولوژيك مورد بررسي قرار گرفتند.
يافته ها: بررسي كشت لنفوسيتي موشها نشان داد ايمني در موشهايC57bl/6 به ميزان بيشتري نسبت به موشهاي Balb/c سركوب شده است، بطوري كه 80% موشهاي C57bl/6 پس از سركوب سيستم ايمني و تلقيح انگل، آلوده شده و 40% آنها پس از تلقـيح انگـلمردند. در حاليكه فقط 20% موشهاي Balb/c آلوده شدند و همه آنها تا پايـان آزمـايش زنـده ماندنـد . همچنـين هيچگونـه تغييـراتهيستوپاتولوژيك در گسترشهاي مربوط به اندامهاي هدف در گروه آزمون نسبت به گروههاي شاهد و سالم مشاهده نشد.
نتيجهگيري: اين مطالعه نخستين گزارش از آلودگي تجربي كريپتوسپوريديوم، تكثير انگل و شبيهسازي كريپتوسپوريديوزيس در نقص ايمني در مدل حيوانات آزمايشگاهي در ايران است. موشهاي C57bl/6 نسبت به Balb/c درآلودگي به كريپتوسپوريديوزيس حساسيت بيشتري نشان دادند.
واژگان كليدي: كريپتوسپوريديوم، دگزامتازون، لنفوسيت، C57bl/6 ،Balb/c، سركوب ايمني.
15246003

مقدمه1
تك ياخته كريپتوسپوريديوم ابتدا توسط كلارك در سال 1895 از سلول هاي اپي تليـالي معـده مـوش جـدا سـازي شـد (1) و

[email protected] :پست الكترونيك
*نويسنده مسئول مكاتبات: دكتر حسين نهروانيان؛ تهران، انستيتو پاستور ايران، گروه انگل شناسي، كد پستي 13164؛
بيماري ايجاد شده كريپتوسپوريديوزيس نامگذاري شـد كـه از بيماريهاي مهم انگلي بوده و گاسـتروانتريت حـاد يـا مـزمن رابوجود مي آورد (2). اولين مورد كريپتوسـپوريديوزيس انسـانيدر سال 1976 در يك كـودك سـه سـاله دچارگاسـتروانتريتشديد مشاهده شـد (3). چرخـه كريپتوسـپوريديوم شـامل دو مرحله جنسي و غيرجنسي است كـه بـا بلعيـدن ااسيسـت هـاشروع مي شود. طي رونـد خـروج از كيسـت، اسـپوروزوئيت هـاخارج شده و پس از حمله به سـلول هـاي اپـي تليـالي، مرحلـهشيزوگوني آغاز شده كه با توليد تروفوزوئيت ها، مروزوئيتهـا وشيزونت ها همراه است. بعضي از مروزوئيـت هـا تمـايز يافتـه وميكرو و ماكروگامتها را ايجاد كرده و مرحله جنسي با لقـاحآنها تكامل مييابد كه با دفع ااسيستهـا همـراه اسـت (4،5).
عفونت كريپتوسپوريديايي مي تواند از طريق آب و غـذا و يـا ازطريق تماس انسان با حيوان آلوده منتقل شود. امكان آلـودگيدر اثر تماس با انگل بسيار بالا بوده بطوري كـه بلعيـدن تعـدادمعدودي ااسيست باعث ابتلا به اين بيماري ميشود (6).
اين انگل در حاشيه ميكروويليهاي اپي تليوم روده ساكن شده و موجب بروز علائم باليني مي گـردد كـه از يـك اسـهال حـادآبكي در افراد بـا ايمنـي كامـل (immunocompetent) كـهخود محدود شونده است شروع و تا گاستروانتريت شديد مزمن در افــــــراد دچــــــار ضــــــعف سيســــــتم ايمنــــــي(immunocompromised) كه مي تواند منجر به مرگ شود، متغير است (7). در افراد با ايمني كامل، بيماري خود محـدودشونده است، تا دو هفتـه طـول مـي كشـد و علائـم آن شـاملاسهال آبكي، تهوع و استفراغ، تب خفيف و دلپيچه است. امـادر افراد با ايمني ناقص علائم شديدتري بروز مي كند كه شامل دلپيچه، ناتواني، بي قراري، تب خفيـف، بـياشـتهايي، كـاهشوزن و اسهال شبه وبايي است. گزارشات مختلف نشان مي دهد كه موارد كريپتوسپوريديوز خارج گوارشي مربوط بـه افـراد بـاسيستم ايمني ضعيف است كه از كريپتوسپوريديوزيس مـزمنرنج برده و انگل در نقاط غيرمعمول بدن ديده ميشود (6).
با اينكه مطالعات زيادي جهت درمان كريپتوسپوريديوزيس در افراد مبتلا بخصوص بيماران با نقص ايمني انجام شـده اسـت،درمان كامل و موثري جهت ا نتريـتهـاي كريپتوسـپوريدياييارائه نشـده اسـت. در درمـان افـراد بـا ايمنـي كامـل، عوامـلض دميكروبي زي ادي از جمل ه نيتازوكس انيد ، پارومايس ين و اسپيراسين مورد آزمايش قرار گرفته انـد كـه تـاثيرات درمـانينسبي در برابر بيماري داشت هانـد (8). بـا توجـه بـه تـاثير كـمدارودرماني در بيماران با ضعف ايمني، ايمونوتراپي با بكارگيري تركيبات مختلف چون كلستروم ايمن گاوي توصيه مي شود كه ميتواند علائم باليني را محدود كرده و اوضاع عمومي بيمـار را بهبود بخشد (9).
با توجه به شيوع كريپتوسپوريديوزيس در مبتلايـان بـه نقـص ايمني و مبتلا به اسـهال، اهميـت مطالعـه ايـن انگـل آشـكارمي شود (10). هنوز اطلاعات كاملي در زمينه شناسايي انگل و آنتي ژنهاي محافظت كننده، مكانيزم ايمني، درمـان و واكسـندر دسترس نيست (11). به علت فقدان يك سيستم in vitroواقعي براي تكثيركريپتوسپوريديوم، مدل هاي حيواني مناسـبجهت كشت in vivo معرفي شده اند (12). مطالعه اين مدل ها براي دستيابي به كريپتوسپوريديوزيس مزمن كه بتوان انگل را تكثير نمود ضروري است كه از آن جمله مـي تـوان از خوكهـا،موشهاي بالغ وحشي، موشـهاي فاقـد تيمـوس و موشـهاي بـاجهش SCID (13)، گوساله ها وبره هاي نـوزاد (12)، رت هـايSprague-Dawley (14)، موشـهاي نـوزاد Balb/c (15) و نژادهايDBA/2N ،C3H/HeN ،C57BL/6 و CBA نام برد (13). بررسيهايي كـه تـاكنون در مـورد كريپتوسـپوريديوم درايران انجام شدهاند اكثراً با رويكرد اپيدميولوژيك بوده و توجـهكمتـري بـه مطالعـات ايمونوپارازيتولوژيـك شـده اسـت. لـذا مشابه سازي بيماري در افراد با نقص ايمني در ميزبـان حيـوانيمي تواند در شناخت بيشتر انگل و تعامل آن با ميزبـان كمـكشاياني داشته باشد. بنابراين، هدف ايـن پـژوهش مـدل سـازيبيماري در حيوانات با نقص ايمني، تلقيح انگلهاي بومي به اين حيوانات، تكثير انگل و بررسـي تغييـرات هيسـتوپاتولوژيك دراين حيوانات آزمايشگاهي و مقايسه تكثيـر آنهـا در دو ميزبـان مختلف است.

مواد و روش ها
براي تهيه ااسيست كريپتوسپوريديوم از نمونههاي انساني و حيواني 80 نمونه مدفوع از گوساله هاي مناطق مختلف شهرستان آمل و همچنين 20 نمونه مدفوع از بخش كودكان بيمارستان امام رضا (ع) آمل جمع آوري شد. سپس اين نمونه ها به آزمايشگاه انگل شناسي پژوهشكده شمال كشور منتقل گرديد. همچنين تعدادي نمونه از دانشكده دامپزشكي دانشگاه تهران نيز جهت تخليص ااسيست تهيه گرديد. پس از آزمايش مستقيم و استفاده از روش تغليظ (concentration) بر روي قسمتي از نمونه، با روشهاي مختلف تشخيص كريپتوسپوريديوم مورد آزمايش قرار گرفت (10).
براي تثبيت نمونهها، تغليظ و تهيه گسترش پس از ملاحظه وضعيت فيزيكي مدفوع حجمي به اندازه 5 گرم از آن را برداشته و در بافر مخصوص فيكساسيون (فرمل- بافر- گليسيرين) بصورت محلول درآورده تا آماده عمل تغليظ شود (16). پس از انكوباسيون در بافر فوق كه براي غير فعال شدن ارگانيزم هاي پاتوژن صورت گرفت، سوسپانسيون حاصله به وسيلهParaseb (Dis. Sys. Co.) مورد آزمايش قرار گرفت و به مدت دو دقيقه با دور 2000 سانتريفيوژ شد. مايع رويي را دور ريخته و از رسوب حاصله جهت تهيه گسترشهاي لازمه استفاده كرديم. براي هر نمونه يك گسترش تهيه نموده وسپس در حرارت آزمايشگاه خشك كرده و بوسيله متانول آنهارا فيكس نموديم. اين گسترش ها با روش اسيد فاسترنگ آميزي شده و وجود انگل بررسي و پس از اثبات آلودگي به كريپتوسپوريديوزيس، در نمونه اوليه (بدون فيكساتور) پس از شستشو، ااسيست هاي آن جداسازي و شمارش شدند (10).
جهت رنگ آميزي اسيد فاست ابتدا گسترش هاي فيكس شده را با كربول فوشين رنگآميزي نموده و به مدت 5- 2 دقيقه آنها را حرارت داده تا رنگ اضافي بخار شود، سپس با آب و اسيد الكل 3% شستشو داده تا رنگ فوشين ناپديد شود. ااسيست هاي كريپتوسپوريديوم رنگ فوشين را به خود گرفته و در مرحله بعدي با مالاشيت گرين 5/0% به مدت 5 دقيقه آن را رنگ نموديم. شستشو با آب و خشك كردن لام در هواي آزمايشگاه انجام شد سپس با ميكروسكوپ نوري لنز 100 مشاهده انگل انجام شد و به اين ترتيب نمونههاي آلوده به كريپتوسپوريديوم شناسايي شدند (9،10).
براي استخراج ااسيست ها و تغليظ آنها بعد از اينكه نمونه مثبت شناسايي شد آن را به مدت 30 دقيقه در g1000 سانتريفيوژ نموده و در دماي C◦4 در محلول تازه K2CR2O نگهداري كرديم. قبل از استفاده، ااسيست ها دو بار در محلول سرم فيزيولوژي شسته شده و با روش فلوتاسيون سوكروز تغليظ شدند. تكنيك گراديانت منقطع ساكارز براي جداسازي ااسيست هاي كريپتوسپوريديوم بر اساس شناورسازي نمونه در محلول قندي بنا شده است. با مخلوط نمودن cc320 محلول سرم فيزيولوژي يا PBS با 500 گرم ساكارز محلول شيترز تهيه شد. cc5 از نمونه مدفوع صاف شده كه در K2CR2O نگهداري ميشد در تركيب فوق ريخته و به مدت 30 دقيقه با دور g1500 سانتريفيوژ شد. سپس با انكوباسيون 24 ساعته، ااسيست ها در اين محلول هيپرتونيك، سبك تر شده به سطح اين مخلوط آمده و سپس به وسيله پيپت آنها را از سطح جداكرده و در محلول PBS و در دماي C◦4 براي دو هفته نگهداري نموديم (9،10).
براي ايجاد يك مدل حيواني مناسب براي كشت كريپتوسپوريديوم و بررسي فيزيوپاتولوژي اين انگل، دو گروه موشهاي Inbred شامل Balb/c و 6/C57bl (تهيه شده از بخش پرورش حيوانات آزمايشگاهي، انستيتو پاستور ايران، مجتمع توليدي تحقيقاتي كرج) را انتخاب كرديم. 15 سر C57bl/6 و 15 سر Balb/cماده 4 تا 6 هفته و با وزن 15 تا
20 گرم براي اين مطالعه در نظر گرفته شدند. هر گروه از موشها به سه دسته تقسيم شدند: گروه سالم (Naive) كه به آنها فقط سرم فيزيولوژي تزريق شد. گروه شاهد كه به آنهادگزامتازون تزريق شد و گروه آزمون كه به آنها علاوه بر تزريق دگزامتازون، ااسيست كريپتوسپوريديوم تلقيح شد. دگزامتازون (Sigma, Chemical Co. UK) با فرمول شيميايي (C22H29FO5) بعنوان داروي سركوب كننده ايمني و دوز تزريقي µg/day125 بصورت داخل صفاقي و به مدت 14 روز تزريق شد.
براي حصول اطمينان از ايجاد نقص ايمني و تاييد آن، لنفوسيت هاي طحال موشهاي گروه سالم و آزمون را جدا نموده و با سيتوژن Con-A كشت داديم. سه روز پس از تحريك به سلولها، تايميدين نشاندار اضافه نموده پس از 18 ساعت سلول ها را جدا نموده و با استفاده از مايع سنتيلاسيون و بتاكانتر ميزان تكثير سلولي را در دو رده بررسي نموده و براي اثبات نقص ايمني، گروه آزمون با گروه سالم مقايسه شدند.
پس از تاييد سركوب ايمني با روشهاي اختصاصي، ااسيست هاي كريپتوسپوريديوم بصورت خوراكي توسط گاواژ به تعداد 104×3 تلقيح شدند. پس از ايجاد آلودگي تجربي، نمونه هاي مدفوع حيوانات آزمايشگاهي هر روز از نظر وجود ااسيست انگل مورد آزمايش قرار گرفت. پس از انجام پاساژهاي مكرر و اثبات آلودگي در حيوانات مورد نظر، آنها را با روشهاي انساني كشته و كليه اجزاء دستگاه گوارش و اندامهاي هدف جدا شده و محتويات Lumen در PBS بصورت سوسپانسيون درآمده و از نظر تكثير انگل مورد بررسي قرار گرفتند.
گسترش هاي لازم تهيه شده و نمونه هاي بافتي از نظر پارازيتولوژيك و هيستوپاتولوژيك مورد بررسي قرار گرفتند.
براي بررسي تكثير انگل در ميزبان مدفوع حيوانات در فيكساتور بصورت سوسپانسيون درآمده و با استفاده از Paraseb و پس از 5 دقيقه در g3000 سانتريفيوژ و رسوب آنها براي شمارش ااسيست ها مورد استفاده قرار گرفت بطوري كه پس از تهيه گسترش، آنها را با متانول فيكس كرده سپس رنگ آميزي با روش اسيد فاست بر روي آنها انجام شد و در مرحله بعدي، لامها با آب شير شستشو داده شد، در حرارت آزمايشگاه آنها را خشك نموده و در پايان با ميكروسكوپ نوري مورد بررسي قرار داديم.
براي بررسي وجود اشكال خارج گوارشي انگل بعد از اينكه مدفوع موشها بررسي شدند و وجود انگل در آن تاييد شد جهت بررسي كريپتوسپوريديوزيس خارج گوارشي، حيوانات مورد آزمايش پس از بيهوشي مورد عمل تشريح قرار گرفتند، سپس روده را كاملاً بيرون آورده و بخشي از آن را جهت بررسي بافت شناسي جدا نموده و بقيه آنرا كاملاً با قيچيتكه تكه كرده و داخل محلول PBS ريخته تا از نظر وجودااسيست مورد بررسي قرار گيرد. اندامهاي هدف چون كبد،طحال و شش را نيز بيرون آورده، بافتهاي حاصله را جهت مطالعه بافت شناسي در فرمالين 10% قرار داده و گسترشهاي فشاري را از بافتهاي فوق تهيه و مورد آزمايش قرار داديم.
جهت تهيه گسترش فشاري تكه اي از بافت مورد نظر را جدا كرده و در يك سانتيمتري لبه لام قرار ميدهيم. لبه لام ديگر را روي اين تكه قرار ميدهيم سپس 2 لام را كاملاً به هم فشار داده و در جهت خلاف آنها را مي كشيم. بافت مورد نظر به صورت يك لايه سلولي روي لامها پخش ميشود. سپس اين لام ها را با چند قطره متانول فيكس كرده و سپس به روش ذيل نلسون رنگآميزي نموده تا وجود ااسيست را در آن بررسي كنيم (9،10).
بافتهاي جدا شده از روده، شش، كبد و طحال نگهداري شده در فرمالين جهت مطالعات هيستوپاتولوژيك به آزمايشگاه تحقيقات باليني انستيتو پاستور ايران منتقل و مورد بررسي قرار گرفتند. بعد از قرار دادن بافت در فرمالين10% به مدت 48 ساعت، آن را در دستگاه Tissue processor پاس داديم و به طور اتوماتيك طبق زمانبندي در اين ظرفها كه محتوي فرمالين10%، الكلهاي80%، 96%، 100%، گزيلول و در نهايت پارافين مذاب بودند، قرار گرفتند. سپس نمونه ها توسط دستگاه ذوب پارافين قالبگيري شدند و قالبي مكعبي شكل از پارافين كه محتوي بافت مورد نظر است به دست آمد. پس از آن دستگاه ميكروتوم را روي 3 ميكرون تنظيم نموديم و از قالبهاي پارافيني برش گيري نموده، آنها را روي لام قرار داده و سپس به ظرف محتوي الكل 30 درجه منتقل كرده و بعد با آب ولرم پارافين آن را ذوب كرده و بر روي لام با چسب سفيده تخم مرغ و گليسرين منتقل نموده و 30 دقيقه در 80 درجه قرار داده تا پارافين داخل بافت مورد نظركاملاً ذوب شود. جهت رنگ آميزي هماتوكسيلين- ائوزين، ابتدا بافت را در گزيلول قرار داده تا پارافين اضافي آن ذوب شود سپس در الكلهاي 100، 90، 80 و70 درجه در هر يك به مدت 5 دقيقه قرار داديم. در نهايت، نمونهها را با آب مقطر شستشو داده و آن را در ظرف حاوي هماتوكسيلين به مدت 10 دقيقه قرار داده و با آب جاري شستشو و در اسيد الكل پاساژ داده، مجدداً با آب جاري شستشو نموده و بعد در كربنات ليتيم قرار داديم. سپس لام را تميز كرده در ائوزين قرار داده و سپس شستشو با آب جاري و در الكلهاي 70، 80، 90 و100 درجه در هر يك به مدت 5 دقيقه قرار داديم. سپس نمونه ها را در گزيلول قرار داده و سرانجام جهت حفظ و تثبيت برش رنگ آميزي شدهلامل را روي لام با چسب كانادا بالزام چسبانديم (12).
نتايج به دست آمده با استفاه از نرمافزار آماري Graph PadPrism و آزمون آماري Student’s t-Test تجزيه و تحليل شد. سطح معنيداري 05/0p< قرار داده شد.

يافته ها
در بررسي كريپتوسپوريديوزيس در نمونه هاي حيواني و انساني، نتايج حاصله سطح پايين آلودگي را در دامداريهاي منطقه مورد بررسي در حومه شهر آمل و در مراكز بهداشتي داخل شهر نشان مي دهد به طوري كه ميزان آلودگي در نمونه هاي حيواني 5/2% و در نمونههاي انساني صفر بوده است. در بررسي محتويات دستگاه گوارش مشخص شد در محتويات گوارشي 20% از موشهاي Balb/c و 80% از موشهاي C57bl/6 ااسيست هاي كريپتوسپوريديوم وجود دارد (شكل 1،
001/0p<). موشهاي C57bl/6 درصد بالايي از آلودگي را نشان دادند. 40% آنها پس از آلودگي مردند، در صورتي كه موشهاي Balb/c مقاومت بيشتري نشان دادند و همه آنها تا پايان آزمايش زنده ماندند (05/0p<).

شكل 1- نتايج حاصل از كشت لنفوسيت هاي طحال در دو گروه از موشهاي همخون C57bl/6 و Balb/c: مقايسه تكثير لنفوسيتهاي طحال در گروه آزمون در مقايسه با گروه سالم در روز هشتم پس از سركوب ايمني با دگزامتازون در دو گروه از موشهاي همخون C57bl/6 و p<0/05) .Balb/c*،
(**p<0/001

برشهاي بافتي اندامهاي كبد، طحال، روده و ريه در گروههاي مورد مطالعه (آزمون، شاهد، سالم) كه به شيوه هماتوكسيلين – ائوزين رنگ آميزي شده بود نشان داد اين بافتها كاملاً سالم بوده و هيچگونه آلودگي در آنها ديده نشد، بطوريكه كريپتوسپوريديوزيس خارج گوارشي در نمونه هاي آزمايش شده مورد تاييد قرار نگرفت.
سيستم ايمني موشها بر اثر تزريق دگزامتازون تضعيف شدبطوري كه موشهاي C57bl/6 حساستر از موشهاي Balb/cدر تقابل با آلودگي بودند. بررسي كشت لنفوسيتي موشها درگروه شاهد نيز نشانگر آن بود كه سطح ايمني در موشهاي C57bl/6 به ميزان بيشتري نسبت به موشهاي Balb/c كاهش يافته است. بنابر اين موشها جهت تكثير و بررسي كريپتوسپوريديوم مناسبتر هستند.

بحث
با توجه به اينكـه كريپتوسـپوريديوزيس در ميزبـان بـا ايمنـيكامل خودمحدود شونده است و حتي در مواردي بدون علائـماست، يافتن ااسيست انگل براحتي صورت نميگيرد. با توجه به اينكه دفع ااسيست ها به طور تصادفي صورت ميگيرد در افراد بدون علائم و با نقص ايمني نيز يافتن ااسيسـت انگـل مشـكلاست (12). از طرفـي چـون حجـم كمـي از نمونـه مـدفوع درآزمايشات بررسي مي شود، ممكـن اسـت ايـن امـر بـه خطـاي آزمايشگاهي در عدم تشخيص نمونههاي آلوده منجر شود كـهحتي در نمونههاي مبـتلا بـه گاسـتروانتريت، ميـزان آلـودگي پاييني گزارش شده است (17).
بررسي ميـزان آلـودگي در موشـهاي گـروه آزمـون نشـان دادسيستم ايمني آنها كه پس از تزريـق دارو تضـعيف شـده بـودموجب تسهيل آلودگي به كريپتوسپوريديوم در اين موشها شد و اين آلودگي در گروه C57bl/6 بيشتر از Balb/c بوده است. بررسي كشت لنفوسيتي موشها در گروه شاهد نيـز نشـانگر آن است كه سطح ايمني در موشهاي C57bl/6 به ميزان بيشتري نسـبت بـه موشـهاي Balb/c كـاهش يافتـه اسـت، بنـابراين،موشهاي C57bl/6 جهت تكثيـر و بررسـي كريپتوسـپوريديوممناسبتر ميباشند. گرچه بررسيهاي كشت لنفوسـيتي نشـانگرافت سيستم ايمني است، ولي عـواملي همچـون مـزمن شـدنبيماري در يك بازه زماني طولاني جهـت پيشـرفت بيمـاري ونفوذ آن به بافتهاي خارج گوارشي از ضروريات است.
اثرات سركوب كنندگي دگزامتازون در مطالعات متعددي مورد اثبات قرار گرفته است، بطوري كه Petry و همكاران ايمني موشهاي بالغ C57bl/6 را با دگزامتازون سركوب كردند و با تلقيح ااسيست انگل آنها به كريپتوسپورديوزيس مبتلا شدند (12). Rasmussen و همكاران، دوزهاي مختلف دگزامتازون را جهت سركوب ايمني در موشها بررسي كردند و مشخص شد كه دوزµg/l/d125بهترين دوز براي سركوب ايمني جهت ايجاد كريپتوسپوريدوزيس مزمن است (18). در اين بررسي اين دوز جهت سركوب ايمني به كار گرفته شد. در تحقيقي كه Brasseur انجام داد به رتهاي ايمونوساپرس شده بهوسيله هيدروكورتيزون استات، 105 ااسيست كريپتوسپوريديوم خورانده شد و اين رت ها چند روز بعد علائم بيماري را بروز دادند (14). در تحقيق Petry و همكاران به موشهاي ايمونوساپرس 106 ااسيست كريپتوسپوريديوم تلقيح شد (12).
شايد يكي از دلايل عدم مشاهده كريپتوسپوريديوزيس خارج گوارشي در مطالعه حاضر تعداد كم ااسيست هاي تلقيح شده (104×3 ااسيست/موش) پايين بودن سطح آلودگي و عدم نفوذ تكياخته مذكور به بافت ها است.
در بررسي بر روي گسترش هاي فشاري و برشهاي رنگ آميزي شده هيچ انگلي يافت نشد. سويه انگل به كار رفته در اين تحقيق C. parvum گاوي بود. بررسيهاي انجام شده توسط Baishanbo و همكاران كه بر روي موش كورهاي با ايمني سركوب شده و مبتلا به C. parvum گاوي انجام شد، عفونت صفراوي در آنها مشخص شد (19). بررسيهاي انجام شده توسط Novak و همكاران بر روي موشهاي Balb/c تازه متولد شده كه ايمني آنها سركوب شده بود نشان داد C. parvum در بافتهاي پانكراس و كيسه صفراي آنها نفوذ كرده است. بنابراين سويه انگل به كار رفته نه تنها بافتهاي گوارشي بلكه بافتهاي خارج گوارشي را نيز آلوده مي كند (15).
به نظر ميرسد طول دوره عفونت در اين بررسي كوتاه بوده است به طوري كه انگل حتي تكثير روده اي محدودي داشته است و لزوم ايجاد كريپتوسپريديوزيس خارج گوارشي، آلودگي مزمن غير درمان شده است (20،21).
مطالعه حاضر مويد تكثير انگل كريپتوسپوريديوم در حيوانات آزمايشگاهي با ايمني سركوب شده است ولي ميزان تكثير آن به گونه موش، ميزان نقص ايمني و تعداد انگل تلقيح شده بستگي دارد. اگر بخواهيم به طور اساسي روي كشت و تكثير، شناخت ساختار و عملكرد انگل و راههاي درمان آن كار كنيم در ابتدا لازم است تا جهت تكثير فراوان انگل اقدام نماييم و محيطهاي كشت و مدلهاي حيواني مناسب را شناسايي كنيم. زيرا يكي از مشكلاتي كه ما در اين مسير داشتيم تهيه ااسيست كافي جهت آلوده كردن موشها بوده است. در گام بعدي لازم است كه محيط آزمايشگاهي ايزوله اي را ايجاد كنيم زيرا سركوب ايمني باعث افت مقاومت اين حيوانات مي شود به طوري كه حيوانات ايمونوساپرس نسبت به انواع عوامل بيماريزا بسيار حساس هستند و به علت پايين بودن سطح ايمني به راحتي در معرض عفونتهاي ناشي از محيط قرار مي گيرند. به علاوه بهتر است به جاي استفاده از يك مدل حيواني ايمونوساپرس از مدل هاي مختلفي استفاده كرد. موشهاي با جهش nude، بدون تيموس و موشهايي كه با موادسركوب كننده ديگر مهار ايمني شده اند احتمالا براي اينمنظور گزينه هاي مناسبي هستند (22- 20). بنابراين كوتاهبودن دوره آزمايش در مطالعه حاضر به انگل فرصت كافي نداده تا به بافتها نفوذ كند. در ضمن بايد تلاش شود تا يك عفونت مزمن كريپتوسپورديايي در اين مدل ها ايجاد شود زيرا لازمه ايجاد كريپتوسپوريديوزيس خارج گوارشي ايجاد عفونت مزمن است كه به مطالعات بيشتري نياز دارد.

نتيجهگيري
موشهاي C57bl/6 نسبت به Balb/c در آلودگي به كريپتوسپوريديوزيس حساسيت بيشتري را نشان داده اند اما به علت كوتاه بودن طول مدت آلودگي، انگل به بافتهاي خارجروده اي منتقل نگرديد و كريپتوسپوريديوزيس خارج گوارشي مشاهده نشد.

تقدير و تشكر
از كليه كاركنان محترم پژوهشكده انسـتيت و پاسـتور ايـران درشمال كشور (آمل) به ويژه خانمها امير بزرگي، اميني و مرادي و همكاران بخش انگل شناسي خانمها اميني و نعيمي و آقايـ ان رحمـاني و اسـفندياري، پرسـنل محتـرم بخشـهاي تحقيقـات باليني و ايمونولوژي انستيتو پاستور ايران در تهران كه ما را در انجام اين مطالعه ياري فرمودند، كمال تشكر را داريم.

REFERENCES
113614263239

.1 Uner A, Inceboz T, Uysalci M, Dagsi H. Immune deficiency and cryptospordiosis in rats. Turk J Vet Anim Sci 2002;27:1187-91.
.2 Marques FR, Cardoso LV, Cavasini CE, de Almeida MC, Bassi NA, Almeida MTG, et al. Performance of an immunoenzymatic assay for cryptosporidium diagnosis of fecal samples. Braz J Infect Dis 2005;9(1):3-5.
.3 Flanigan TP, Soave R. Cryptosporidiosis. Prog Clin Parasitol 1993:1-20.
.4 Keusch GT, Hamer D, Joe A, Kelley M, Griffiths J, Ward H. Cryptosporidia; who is at risk? Schweiz Med Wochenschr 1995;125(18):899-908.
.5 Hannahs G. Cryptosporidium parvum: an emerging pathogen. Available at: http://biology.kenyon.edu/ slonc/bio38/hannahs/crypto.htm.
.6 Juranek DD. Cryptosporidiosis: sources of infection and guidelines for prevention. Clin Infect Dis 1995;21 Suppl 1:S57-61.
.7 Xiao L, Fayer R, Ryan U, Upton SJ. Cryptosporidium taxonomy. Recent advances and implications for public health. Clin Microbiol Rev 2004;17(1):72-97.
.8 Geze MP, Blanchard P, Fourrey JL, Robert-Gero M. Synthesis of sinefungin and its c-6′ epimer. J Am Chem Soc 1983;105:7638-40.
9. نهروانيان ح. مطالعه كريپتوسپوريديوم در بيماران مبتلا به نقص ايمني در تهران. پايان نامه كارشناسي ارشد. دانشكده بهداشت، دانشگاه علوم پزشكي تهران.
سال 1372.
.01 Nahrevanian H, Assmar M. A case report of cryptosporidiosis and isosporiasis in AIDS patients in Iran. J Trop Med Parasitol 2006;29(1):33-6.
.11 Current L, Garcia LS. Cryptosporidiosis. Clin Microbiol Rev 1991;4(3):325-58. .21 Petry F, Robinson HA, McDonald V. Murine infection model for maintenance and amplification of Cryptosporidium parvum oocysts. J Clin Microbiol 1995;33(7):1922-24.
.31 McDonald V, Deer R, Uni S, Iseki M, Bancroft GJ. Immune responses to Cryptosporidium muris and Cryptosporidium parvum in adult immunocompetent or immunocompromised (nude and SCID) mice. Infect Immun 1992;60(8):3325-31.
.41 Brasseur P, Lemeteil d, Ballet, JJ. Curative and preventive anticryptosporidium activities of sinfungin in immunosuppressed adult rat model. Antimicrob Agent Chem 1993;37:889-92.
.51 Novak SM, Sterling CR. Susceptibility dynamics in neonatal Balb/c mice infected with Cryptosporidium parvum. J Protozol 1991;38(6):S102-S104.
.61 Gardner AL, Roche JK, Weikel CS, Guerrant RL. Instestinal cryptosporidiosis pathophysiologic alterations and specific cellular and humoral immune responses in RNU/+ and RNU/RNU athymic rats. Am J Trop Med Hygiene 1991;44(1):49–62.
17. قربانيان ع، نهروانيان ح، اميرخاني ع و همكاران. فراوانـي كريپتوسـپوريديوزيس ، ايزوسـپوريديوزيس و سـاير انگلهـاي انتروپاتوژنيـك در بيمـاران مبـتلا بـهگاستروانتريت. مجله دانشگاه علوم پزشكي بابل 1387؛ سال 10 شماره 2، صفحات 56 تا 67.
.81 Rasmussen KR, Healey MC. Experimental Cryptosporidium parvum infections in immunosuppressed adult mice. Infect Immun 1992;60(4):1648-52.
.91 Baishanbo A, Gargala G, Duclos C, François A, Rossignol JF, Ballet JJ, et al. Efficacy of nitazoxanide and paromomycin in biliary tract cryptosporidiosis in an immunosuppressed gerbil model. J Antimicrob Chemother 2006;57:353-55.
.02 Ungar BLP, Burris JA, Quinn CA, Finkelman FD. New mouse models for chronic cryptosporidium infection in immunodeficient hosts. Infect Immun 1990;58:961-69.
.12 Nahrevanian H, Assmar M. Cryptosporidiosis in various immunocompromised patients in the Islamic Republic of Iran. J Microbiol Immunol Infec 2008;41(1):74-7.
.22 Nahrevanian H, Assmar M, Ghorbani Samin M. Cryptosporidiosis among immunocompetent patients with gastroenteritis in Tehran, I. R. Iran; A comparison with other enteropathogenic parasites. J Microbiol Immunol Infect 2007;40(2):154-56.



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید