پژوهنده (مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشك ي شهيد بهشتي) تاريخ دريافت مقاله: 4/10/87 سال چهاردهم، شماره 4، پي در پي 70، صفحات 199 تا 203 تاريخ پذيرش مقاله: 30/6/88 مهر و آبان 1388

بررسي امكان تهيه و توليد بانك استاندارد فيبروبلاست انساني
دكتر حميده مروج1، دكتر مهناز محمودي راد1*، دكتر نريمان مصفا2، منصوره ميرزائي3، دكتر پرويز طوسي4

دانشيار، مركز تحقيقات پوست، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
استاد، گروه ايمونولوژي، دانشكده پزشكي، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
كارشناس ارشد علوم تشريح، بيمارستان بوعلي ساري، دانشگاه علوم پزشكي مازندران
-9890224900

استاد، مركز تحقيقات پوست، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي چكيده
سابقه و هدف: فيبروبلاستها سلولهاي مزانشيمي هستند كه به آساني در آزمايشگاه كشت داده مي شوند و نقش مهمـي در تقـابلاتمزانشيم و اپيدرم و ترشح فاكتورهاي رشد و سايتوكاينها مختلف دارند كه اثر مستقيمي بر رشد و تمايز اپيـدرم و تـشكيل مـاتريكسخارج سلولي دارند. تحقيق حاضر با هدف بررسي امكان تهيه و توليد استاندارد فيبروبلاست انساني صورت گرفت.
مواد و روشها: تحقيق به روش اكتشافي انجام گرفت. از ناحية درم پوست ختنـهگـاه نـوزاد بـراي تهيـة فيبروبلاسـت اسـتفاده شـد.
فيبروبلاستها توسط آنزيم تريپسين جدا گشته و به منظور ايجاد بانك فيبروبلاست چندين بار در محيطDMEM كشت داده شـدند.
سلول ها از نظر آلودگيهاي باكتريايي و ويروسي با روشهاي مو لكولي و از نظر كاهش عرضة آنتـي ژن هـايMHC تـا پاسـاژ دهـم مـوردبررسي قرار گرفتند. همچنين براي يافتن اختلالات ژنومي، كاريوتايپ سلولهاي پاساژهاي اول، پنجم، دهم و بيست و دوم تعيين شد.
يافته ها: فيبروبلاستهاي به كاررفته براي توليد بانك سلول از نظر وجود برخي وي روسها و باكتريها به روشهاي مولكولي مورد بررسيقرار گرفته كه نتايج همگي منفي بود. بررسي سلولهاي پاساژ داده شده از لحاظ ميزان عرضة آنتيژنهايMHC در سطح آنها نـشانداد كه ميزان اين آنتيژنها به مرور در طي پاساژها كم شده است. نتيجة كاريوتايپينگ سلولهاي فيبروبلاست پاساژ اول، پنجم و دهم طبيعي بود ولي كاريوتايپينگ فيبروبلاستهاي پاسا ژ بيستودوم نشاندهندة ناهنجاري هاي زيادي در كروموزومهاي اين سـلولهـا بـود.
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:11 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:11 +0330 on Wednesday January 10th 2018

جداشدگي كروموزومها از محل سانترومر در تعداد قابل توجهي از كروموزومها مشاهده شد.
نتيجه گيري: بهترين زمان براي ايجاد يك بانك فيبروبلاست از نظر حداكثر ميزان فعاليت فيبروبلاستها، كمترين ميزان آنتي ژنيسيتي و نيز عدم وجود اختلالات ژنتيكي، سلولهاي پاساژ پنجم تا دهم است. براي ممانعت از بروز اختلالات ژنتيكي در فرايند كـشت مجـددفيبروبلاستها بايد تمهيداتي از جمله انتخاب بهترين كلونها از نظر عاري بودن از ناهنجاريهاي كروموزومي در كاريوتاپينـ گ و نيـز بـهحداقل رساندن زمان جداسازي سلولها در روش آنزيماتيك مد نظر قرار گيرند.
واژگان كليدي: فيبروبلاست، بانك سلولي، كاريوتايپينگ، ايمونوفنوتايپينگ.
281205834

مقدمه1
فيبروبلاست يك سلول مهم است كه در همـه مراحـل تـرميمزخم دخالـت دارد. بخـش زيـادي از فيبروبلاسـت هـاي زخـم ميوفيبروبلاست هـا هـست ند كـه در بـسته شـدن زخـم ظـاهرميشوند. التيام زخم، حاصل مجموعه وقايع بيولـوژيكي اسـتكه منجر به احيا و پيوستگي بافت مي شـود . فازهـاي مختلـفاين فرآيند عبارتند از: التهاب، تكثير، تجديد سـاختار. در طـي
*نويسنده مسئول مكاتبات: دكتر مهناز محمودي راد؛ تهران، بيمارستان شهدايتجريش، مركز تحقيقات پوست، صندوق پستي 1989934148.
[email protected] :پست الكترونيك
فـاز التهـاب، هموسـتاز و ارتـشاح سـلولهاي التهـابي حـاد رخ مي دهد (1).
در ايـن ميـان فيبروبلاسـتهـا نقـش محـوري در فرآينـدهايرسوب ماده بين سلولي و تجديد ساختار بافت ترميمـي دارنـد.
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:11 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:11 +0330 on Wednesday January 10th 2018

فيبروبلاست هم در نقش سـلول سـازنده ظـاهر مـي شـود كـهماتريكس غني از كلاژن را توليد ميكند و هم به عنوان سـلولپيام دهنده (signaling cell) عمـل مـي نمايـد و فاكتورهـايرشد را ترشح مي كند كه براي ارتباط بـين دو سـلول در طـيفرآيند التيام مهم است . بروز وقفه در فرآيند التيـام زخـم يـكمشكل مهم باليني است كه هزينـه هـاي زيـادي را بـر جامعـهتحميل مي كند (3،2).
لايه پاپيلار كه واجـد فيبروبلاسـت هـاي اصـلي پوسـت اسـت فاكتوري مهم كه براي آغاز فراينـد تكثيـر اپيـدرم مـورد نيـازاست، توليد مي نمايد. سلول اصلي درم فيبروبلاست اسـت كـهگليكوپروتئين هاي ماتريكس خارج سلولي، فيبرهاي الاسـتيكو رتيك ولر، گليكوزآمينوگليك ان ه ا و ان واع ك لاژن را تولي د مي كند. اين سلول ها پروتئين هاي كليـدي اتـصالي اپيـدرم بـهلايه بازال هستند كه در مهاجرت و تكثير سلول هاي اپيـدرمينقش دارند . فيبرونكتين، مشتق كليـدي سـلول فيبروبلاسـت، معرف التيام است (4). كلاژن فراوانتـرين پـروتئين موجـود دربافت هاي حيوان ي است كـه نقـش مهمـي در هموسـتاز بافـتهمبن د ب ه عه ده دارد. فيبروبلاس ت ه ا س لول ه اي اص لي توليدكننده كلاژن هستند و مسئول بازسـازي(remodeling) آن مي باشند (5).
با توجه به نكات فوق و وجود انواع زخمهـاي مـزمن ديابتيـك،سوختگي، زخم بستر، زخمهاي مزمن بعد از عمل جراحي و بهمنظور مطالعات بيوتكنولـوژي و توليـد فـرآوردههـاي انـساني،بررسيهاي و يـروسشناسـي (بـه عنـوان وكتورهـاي انـساني) و همچنين اختلالات ژنتيكي و با توجه به اهميـت نقـش سـلولفيبروبلاست در فرآيند التيام زخم و آزمايشات سيتوژنتيك نيازبه داشتن يك بانك سلولي اسـتاندارد بـراي نگهـداري سـلولفيبروبلاست كشت داده شده، ضروري اسـت چراكـه تجربيـاتديگر كش ورها تهيه و توليد بانك استاندارد فيبروبلاست انسانيرا مورد تاييد قرار داده است (8-6). لذا تحقيق حاضر با هـدفبررسي امكان تهيه و توليد بانك استاندارد فيبروبلاست انسانيدر مركز تحقيقات بيماريهـاي پوسـت دانـشگاه علـوم پزشـكيشهيد بهشتي صورت گرفت.

مواد و روش ها
تحقيق به روش اكتشافي انجام گرفت. در اين تحقيق از پوست ختنه گاه نوزاد در اطاق عمل تحت شرايط كاملاً استريل نمونه برداشته در محيط DMEM حاوي آنتي بيوتيك (پني سيلين ، استرپتومايسين و فونژيزون به ميزان ده برابر غلظت در مقايسه با محيط كشت سلول) قرار داده شد، سپس به اطاق كشت منتقل گرديد. تمام مراحل جداسازي بافت از پوست مورد نظر زير هود لامينار و با استفاده از مواد، معرفها و وسايل استريل انجام شد. كشت و ايجاد بانك فيبروبلاست انساني در مركز تحقيقات پوست دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي، پس از كسب رضايت والدين نوزاد، انجام شد.
200/ دوماهنامه پژوهنده بررسي امكان تهيه و توليد بانك استاندارد
كشت فيبروبلاست: براي جدا كردن سلولها، نمونة پوست از محلول DMEM حاوي آنتي بيوتيك خارج و با محلول PBS شستشو داده شد. با تريپسينه كردن، اپيدرم طي چند مرحله از درم جدا گرديد و سپس درم به قطعات كوچكتر از 1 ميليمتر تقسيم و با روش explantation در فلاسكهاي كشت 50 ميلي ليتر كشت داده شد. آنگاه در انكوباتور 37 درجة سانتيگراد با 5% دي اكسيدكربن قرار داده شد. سپس محيط كشت كامل شامل: محيط كشت DMEM با 10% سرم جنين گاوي (L-gluamine ،(fetal bovine serum، پني سيلين 100 واحد در هر ميلي ليتر، استرپتومايسين 100 ميكروگرم در هر ميلي ليتر و فونژيزون 1 ميكروگرم در هر ميلي ليتر، به فلاسك اضافه گرديد. پس از آن سلولهاي كشت داده شده هر سه روز يكبار تغذيه شدند. در زماني كه به هم پيوستگي كلنيها صورت گرفت، با تريپسينه كردن
(tripsinization) كوتاه مدت، فيبروبلاست ها از ساير سلول ها جدا شد و پس از تهيه سوسپانسيون و سانتريفوژ، فيبروبلاست هاي جمع و در يك فلاسك جديد كشت داده شد. كشت مجدد اين سلولها با اين روش تا پاساژ بيستودوم به مدت 5 ماه ادامه پيدا كرد و پاساژهاي پنجم تا دهم در 80- درجة سانتيگراد ذخيره شدند. در واقع نمونه هاي آماده شده در كرايوويال قرار داده شدند و پس از نصب برچسب مشخصات در 80- درجة سانتيگراد براي مصارف بعدي ذخيره گرديدند.
در نهايت براي حفظ طولاني مدت، سلول ها از فريزر خارج شدند و بعد از بررسي آنها از نظر زمان دو برابر شدن و نيز ميزان سلول هاي زنده (حداقل تعداد 107 سلول در هر ميليليتر)، در بهترين شرايط به تانك ازت منتقل شدند.
ايمونوفنوتايپينگ براي ارزيابي وضعيت عرضة مولكول هاي MHC: در تهيه اين بانك فيبروبلاست با توجه به كاربرد آن در آلوگرافت هاي پوستي، از بين رفتن آنتي ژن هاي سطحي تا پاساژ دهم توسط immunocytochemistry با monoclonal ،monoclonal anti HLA class I FITCanti HLA DQ-FITC وmonoclonal anti HLA DR-FITC (Sigma,Cat No:F5662, F1777, F1902) بررسي گرديد. از non-specific mouse immunoglobulin M (negative control, Sigma Cat No. 5284) به عنوان كنترل منفي استفاده شد و ماكروفاژهاي كشت شدة انساني به عنوان كنترل مثبت در نظر گرفته شدند.
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:11 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:11 +0330 on Wednesday January 10th 2018

در ابتدا سلول ها روي slide chamber 4حفره اي (Nunc lab-tek, Cat No.C6932) ريخته شد و پس از تشكيل يك لاية سلولي، سلول ها توسط تركيب استن و اتانول سرد به نسبت دو به سه به مدت 8 دقيقه فيكس گرديدند. بعد از شستشو، مقدار 10 ميكروليتر از هر آنتي بادي به بافر رقيق كننده شامل سديم آزايد، bovine serum albumin و PBS اضافه و به حفره ها افزوده ميشد و پس از شستشو بلافاصله نمونه ها با ميكروسكوپ ايمونوفلورسانس (Nikon) بررسي مي گرديد (6).
بررسي آلودگي هاي ميكروبي: به منظور بررسي وجود هر گونه آلودگي كه مختص محيطهاي كشت سلول است،
،HBV فيبروبلاست هاي پاساژهاي پنجم تا دهم از نظر ،Treponema pallidum ،CMV ،EBV ،HSV I ،HSV II و از نظر DNA با آناليز Chlamydia و Mycoplasma spp.
HCV و HIV با آناليز RNA بررسي گرديدند.
به ترتيب از HCV و HBV نمونه ها از نظر PCR براي AMPLICOR HBV & HCV MONITOR® كيت هاي
.استفاده شد (Roche Diagnostics, USA) Test, v2.0 DNeasy Tissue Kitارزيابي بقية ميكروارگانيسم ها توسط (QIAGEN,Cat. No.: 69504, Crawley, United Kingdom) صورت گرفت PCR و با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي .(7-14)
كاريوتايپينگ فيبروبلاستها: در اين تحقيق سلولهاي پاساژهاي اول، پنجم، دهم و بيست ودوم از نظر كاريوتايپ بررسي شدند تا از وضعيت كروموزومي نمونه ها اطلاعاتي حاصل شود. سلول هاي فيبروبلاست تكثير شده در آزمايشگاه پس از تيمار با كلشي سين و متوقف كردن تقسيم سلولي در مرحله متافاز محصول برداري شده و براي تهيه گسترة متافازي مراحل فيكساسيون و تهيه لام انجام شد (16،15).

يافته ها
ايمونوفنوتايپينگ: بررسي سلول هاي پاساژ داده شده از لحاظ ميزان بروز آنتيژن هاي MHC در سطح آنها نشان داد ميزان اين آنتيژن ها به مرور در طي پاساژها كم شده است و در پاساژ دهم خيلي ضعيف گرديده است. همچنين ميزان عرضة آنتي ژن HLA كلاس I در فيبروبلاستهاي پاساژ 1 نسبت به ماكروفاژها (كنترل مثبت) حدود 80%، در فيبروبلاست هاي پاساژ 5 حدود 40% و در فيبروبلاست هاي پاساژ 10 حدود 10% مي باشد.
آلودگي ميكروبي سلول ها: آناليز DNA و RNA براي تشخيص آلودگي سلول ها همگي منفي بودند.
شماره 4، پي در پي 70، مهر و آبان 1388 دكتر حميده مروج و همكاران/ 201
كاريوتايپينگ: از فيبروبلاست پاساژهاي اول، پنجم و دهم تعداد 20 گسترش متافازي با تكنيك GTG مورد مطالعه قرار گرفت و 46 كروموزوم بدون هيچگونه اختلال كروموزومي مشاهده گرديد. ولي در مورد فيبروبلاست هاي پاساژ بيستودوم كاريوتايپينگ نشاندهندة ناهنجاريهاي متعدديدر كروموزوم هاي اين سلول ها بود. شكستهاي سانترومريك متعددي در گسترشهاي متافازي ديده شد و تشخيص كروموزوم هاي مختلف به علت بازآرايي پيچيده و حذف برخي از نواحي ممكن نبود. كلني هاي متعددي در اثر كشتهاي مجدد تشكيل شده بودند. اين تغييرات منحصر به كروموزوم خاصي نبوده و از نظر تعداد و ساختمان در كروموزوم هاي مختلف ناهنجاريهايي مشاهده شد كه نشان مي دهد اكثر سلول ها نه تنها از نظر تعداد در حد ديپلوييد يا سلول سالم نمي باشند بلكه جداشدگي كروموزومها از محل سانترومر در تعداد قابل توجهي از كروموزوم ها مشاهده ميشود (شكل 1).

شكل 1- ناهنجاري هاي كروموزومي در چهار گسترش متافازي تهيه شده از فيبروبلاستهاي پاساژ 22

بحث
در ساليان گذشته، از فيبروبلاستهاي پاساژهاي پنجم تا دهم به منظور پيونـد و تـسريع سـاخته شـدن اپيـدرم در بيمـارانسوختگي استفاده شده است . اين روش به دليل كاهش عرضـةآنتيژن هاي سطحي فيبروبلاست ها در پاساژهاي متعدد صورت ميگيرد تـا پيونـد سـلولهـاي غيرخـودي امكـانپـذير باشـد (19-17). در مطالعة حاضر كه با همـين روش صـورت گرفـتدر ســلولهــاي پاســاژهاي اول تــا دهــم هيچگونــه اخــتلالكروموزومي مشاهده نشد. اين پاساژها تا بيستودو پاساژ ادامهيافت تا از نظـر زمـان پيـدايش اخـتلالات كرومـوزومي مـورد بررسي قـرار گيرنـد . در فيبروبلاسـتهـاي پاسـاژ بيـستودوم اختلالات كروموزومي متعددي يافت شد.
هرگونه پريشاني كروموزومي و تغييرات وراثتي را مـي تـوان بـاشمارش كروموزومي و تجزيـه و تحليـل كاريوتـايپي ملاحظـهكرد. اصولا تغييرات وراثتي در تيرههـاي ياختـهاي كـموبـيشوج ود دارن د. اي ن ناپاي داريها ناش ي از س اختمان ب ينظ م كروموزوم ها است. حتي در كشتهاي كوتاه مدت، گرچه ممكـناست از نظر وراثتي پايدار باشند، ناهمگني مجموعه ياختـه بـاتوجه به ميزان رشد ياخته از يك پاساژ به پاساژ بعدي مي تواند تغييراتي به همراه داشته باشد (15).
ناهنجاريهاي كروموزومي و شكستهاي سـانترومريك متعـدديكــه در گــسترش هاي متافــازي در فيبروبلاســتهــاي پاســاژبيست ودوم در اين بررسي ديده شد، تشخيص كرومـوزومهـايمختلف را به علت بازآرايي پيچيـده و حـذف برخـي از نـواحيغيرممكن ساخته بود. همچنـين كلنـيهـاي متعـددي در اثـرك شتهاي مج دد ت شكيل ش د. اي ن گون ه تغيي رات وس يعكروموزومي از ويژگيهاي سلول هاي سرطاني است كه به دليـلســرعت تكثيــر، تقــسيمات ســلولي متــوازني را پــشت ســر نميگذارند. لذا بايـد تمهيـداتي در نظـر گرفتـه شـود تـا ايـنسلولها نيز قابل استفاده براي ايجاد بانك سلولي با مقاصد يادشده باشند چرا كه هر چه تعداد پاساژها بيـشتر باشـد، ميـزانحذف آنتيژن هاي سطحي بيشتر خواهد شد.
هانسون و همكارانش شرايط كشت در محيط آزمايشگاه و نيـزروشــهاي كــشت را در ايجــاد اخــتلالات كرومــوزومي مــؤثرميدانند. آنها نشان دادند در پاساژ سلولها به روش مكـانيكي، سلولها پـس از 35 مـاه كـشت دچـار تغييـرات كرومـوزومينشدند (16).
202/ دوماهنامه پژوهنده بررسي امكان تهيه و توليد بانك استاندارد
ناهنجاريهاي كروموزومي بيشتر در پاساژهايي ديده ميشود كهدر آن ها از آنزيم يا مواد شيميايي استفاده ميشود. علاوه بـر آندر اين موارد انتخاب سلولها امكانپذير نيست در حالي كه درپاساژهاي مكانيكي اين امكان وجود دارد. وقتـي كلـوني هـا بـهروش مكانيكي به قسمتهاي كوچك تر تقسيم مـي شـوند، كلـون كردن بر اساس شكل سلولها صورت ميگيرد و كلنيهايي كهتغيير شكل يافته اند، پاساژ داده نمي شوند.
در مواردي كه از آنزيم استفاده ميشود، احتمـال تغييراتـي درسلولها به واسطة حساسيت آنها به آنزيمها وجود دارد. عوامل ديگري نظير اسـتفاده از بـسترهايي بـا منـشا حيـواني و سـرمممكن است با افزايش تغييرات ژنتيكي همراه گردد. در بر رسي كاي ساندر و همكارانش از روش مكانيكي براي پاساژ سلولها تا 134 پاساژ استفاده و نشان داده شد كاريوتايپ ايـن سـلولهـاتغييري پيدا نكرده است. در اين مطالعه توصيه شـده اسـت ازكاريوتايپينگ و ياCGH براي آناليز ابتدايي سلولهـا ، بعـد ازذوب و انجمادها و نيـز در زمـان كـشتهاي طـولاني مـدت درشرايط آزمايشگاه، استفاده شود (15).

نتيجه گيري
بهترين زمان براي ايجاد يك بانك فيبروبلاست از نظر حداكثرميزان فعاليت فيبروبلاستها، كمترين ميزان آنتـيژنيـسيتي ونيز عدم وجود اختلالات ژنتيكي، سلولهـاي پاسـاژ پـنجم تـادهم است. براي ممانعت از بروز اخـتلالات ژنتيكـي در فراينـدكشت مجدد فيبروبلاستها بايـد تمهيـداتي از جملـه انتخـاببهترين كلونها از نظر عاري بودن از ناهنجاريهاي كرومـوزوميدر كاريوتاپينگ و نيـز بـه حـداقل رسـاندن زمـان جداسـازيسلول ها در روش آنزيماتيك مد نظر قرار گيرند.

تقدير و تشكر
نويسندگان از همكـاري آقـاي دكتـر حـسين كيـواني، رئـيسآزمايشگاه ويروسشناسي كيوان ، آقاي دكتر كريمينژاد رئـيسآزمايشگاه ژنتيك كريمينژاد، سركار خانم ياسمن ميردامادي وسركار خانم نيكي محمـوديراد كارشناسـان آزمايـشگاه مركـزتحقيقات پوست كمال تشكر را دارند.

1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:11 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:11 +0330 on Wednesday January 10th 2018

شماره 4، پي در پي 70، مهر و آبان 1388 دكتر حميده مروج و همكاران/ 203
REFERENCES
.1 Lorenz HP, Longaker MT, editors. Wounds: biology, pathology, and management; Basic science and clinical evidence. New York Inc, 2001;p:221-36.
.2 Takehara K. Growth regulation of skin fibroblasts. J Dermatol Sci 2000; 24 suppl 1:S70-S77.
.3 Mansbridge JN, Liu K, Piney RE, Patch R, Ratcliffe A, Naughton GK. Growth factors secreted by fibroblasts: role in healing diabetic foot ulcers. Diabetes Obes Metab 1999;1:265-79.
.4 Çinar S, Artificial Skin, Biomaterials Research Group, Middle East Technical University-Biotechnology Research Unit. 2006. Available from: http://www.biomed.metu.edu.tr/courses/term_papers/artificial%20skin_cinar.htm.
.5 Christine A, Shearwood C, Walker M, Bowler P, Detek C. The application of a fibroblast gel contraction model to assess the cytotoxicity of topical antimicrobial agents. Wounds 2003;15(8):265-27.
.6 Branchet MC, Boisnic S, Bletry O. Expression of HLA class II antigens on skin fibroblasts in scleroderma. Br J Dermatol 1992;126(5):431-5.
.7 Benjamin DK, Miller WC, Fiscus SA. Rational testing of the HIV-exposed infant. Pediatrics 2001;108(1):e3.
.8 Kimura M, Kuzushima K, Nishikawa K, Nishiyama Y, Morishima T. Detection and direct typing of herpes simplex virus by polymerase chain reaction. Med Microbiol Immunol (Berl) 1990;179:177–84.
.9 Landers RJ, O’Leary JJ, Crowley M. Epstein-Barr virus in normal, pre-malignant, and malignant lesions of the uterine cervix. J Clin Pathol 1993;46:931–5.
1927860840486

1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:11 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:11 +0330 on Wednesday January 10th 2018

.01 Chang MS, Kim WH, Kim CW, Kim YI. Epstein-Barr virus in gastric carcinomas with lymphoid stroma. Histopathology 2000;37:309–15.
.11 Bitsch A, Kirchner H, Dupke R, Bein G. Cytomegalovirus transcripts in peripheral blood leukocytes of actively infected transplant patients by reverse transcriptase polymerase chain reaction. J Infect Dis 1993;167:740–43.
.21 Siqueira JF, Rôças IN, Favieri A, Santos KRN. Detection of Treponema denticola in endodontic infections by 16S rRNA gene-directed polymerase chain reaction. Oral Microbiol Immunol 2002;15(5):335-37.
.31 Rawadi G, Dussurget O. Advantages in PCR-based detection of mycoplasmas contaminating cell cultures. PCR Methods Appl 1995;4:199–208.
.41 Bauwens JE, Clark AM, Loeffelholz MJ, Herman SA, Stamm WE. Diagnosis of Chlamydia trachomatis urethritis in men by polymerase chain reaction assay of first-catch urine. J Clin Microbiol 1993;31:3013– 16.
.51 Caisander G, Park H, Frej K, Lindqvist J, Bergh C. Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res 2006;14:131–37.
.61 Hanson C, Caisander G. Human embryonic stem cells and chromosome stability. APMIS 2005;113(11-12):751–5.
.71 Sarkisov DS, Alekseev AA, Tumanov VP, Glushchenko EV, Morozov SS, Paltsyn AA. Cultured human skin cells in the treatment of burns. Khirurgiia (Mosk) 1993;(3):22-7.
.81 Glushchenko EV, Alekseev AA, Tumanov VP, Serov GG. The treatment of thermal skin burns by using cultured fibroblasts. Arkh Patol 1994;56(5):29-34.
.91 Tumanov VP, Alekseev AA, Budkevich LI. 10 years’ experience of using cultured human skin cells for the treatment of thermal burns. Arkh Patol 1999;61(4):5-9.



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید