پژوهنده (مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي) تاريخ دريافت مقاله: 8/8/87
سال چهاردهم، شماره خرداد2 ،و پيتير در پي 1388 68، صفحات 67 تا 72 تاريخ پذيرش مقاله: 22/1/88

بررسي ژن هاي متالوبتالاكتامازي blaVIM-1 ،blaIMP-1 و blaSPM-1 در سويه هاي
پسودوموناس آئروژينوزا ي ايزوله شده از بيمارستان امام خميني تهران دكتر فرشته شاهچراغي1*، وجيهه سادات نيك بين2، فهيمه شورج3، مرواريد شفيعي2

استاديار، بخش ميكروبشناسي، انستيتو پاستور ايران
كارشناس ارشد ميكروبيولوژي، بخش ميكروبشناسي، انستيتو پاستور ايران
-9904206369

كارشناس ميكروبيولوژي، بخش ميكروب شناسي، انستيتو پاستور ايران چكيده
سابقه و هدف: بتالاكتامازهاي كلاس B از جمله VIM ،IMP و SPM، كه متالوبتالاكتاماز (MBL) خوانده مي شوند، بـه دليـل اثـر بـرطيف وسيعي از آنتيبيوتيك ها از جمله پنيسيلين ها، سفالوسپورينهاي وسيعالطيف و كرباپنمهـا (بـه اسـتثناي مونوباكتـام هـا ماننـدآزترونام) از مشكلات عمده درمان بيماريهاي عفوني به شـمار مـي رونـد . در ايـن مطالعـه، شـيوع ژن هـاي متالوبتالاكتامـازي blaIMP-1، blaVIM-1 وblaSPM-1 در سويههايپسودوموناس آئروژينوزا ي مقاوم به ايميپنم جدا شده از نمونههاي كلينيكي بيمارستان امام خمينـيتهران بررسي شد.
مواد و روشها: مجموع 243 سويهپسودوموناس آئروژينوزا از بيمارستان امام خميني تهران، جمع آوري شده و پـس از تعيـين حـداقلغلظت بازدارندگي (minimum Inhibitory Concentration; MIC) ايمـيپـنم، سـويه هـاي دارايMIC≥4 µg/ml بـه روشDDST بـا استفاده ازEDTA براي تشخيص سويههاي مولدMBL بررسي شدند. آزمونPCR اين سويهها نيز با استفاده از پرايمرهاي اختـصاصي ژنهايblaIMP-1 ،blaVIM-1 و blaSPM-1 انجام شد.
يافته ها: در مجموع، 28 سويه دارايMIC≥4 µ g/ml نسبت به ايمي پنم بودند. از اين تعداد، 22 سـويه بـه روشDDST مولـدMBL بوده و 15 سويه به روشPCR ، حاوي ژنblaVIM-1 بودند . ساير ژن هاي مورد بررسي در اين سويهها يافت نشد. تمامي اين سويه هـا بـهكليستين و پلي ميكسين B حساس بودند.
نتيجهگيري: در اين مطالعه، blaVIM-1، ژن غالب در سويههاي پسودوموناس آئروژينوزاي مقـاوم بـه ايمـي پـنم جداشـده از نمونـههـايكلينيكي مورد بررسي بود. با توجه به اهميت سويههاي مولد متالوبتالابتالاكتاماز در بيمارستان ها، شناسا يي سريع و رديابي اين سويهها مي تواند گامي مهم و اساسي در درمان و كنترل عفونت هاي ناشي از اين سويه ها به شمار رود.
واژگان كليدي: متالوبتالاكتاماز VIM-1، متالوبتالاكتاماز IMP-1، متالوبتالاكتاماز SPM-1، پسودوموناس آئروژينوزا، ژن هاي متالوبتالاكتاماز
15258019

مقدمه1
كرباپنم ها از جمله آنتي بيوتيك هاي بتالاكتام ي وسـيع الطيـف،مؤثر بر باكتري هاي گرم منفي و گرم مثبت به شمار مي رونـد . اين آنتي بيوتيك ها، نسبت به سفالوسپورينازها و پني سيلينازها مقاوم هستند . با اين وجود، بعضي از بتالاكتامازهاي گروههـاي A ،B و D گروه بندي شده توسط Ambler مي توانند كرباپنم ها را هيدرولي ز نمايند (1). در اين ميان، بتالاكتامازهاي كـلاسB
*نويسنده مسئول مكاتبات: دكتر فرشته شاهچراغي؛ تهران، خيابان پاستور، انستيتو پاســــتور ايــــران، بخــــش ميكــــ روبشناســــي؛ پــــست الكترونيــــك:
[email protected]
كه متال وبتالاكتاماز (MBL) خوانده مي شـوند، از آنجـا كـه بـرطيـف وسـيعي از آنتـ يبيوتيـك هـا از جملـه پنـي سـيلين هـا، سفالوسپورينهـاي وسـيعالطيـف و كربـاپنم هـا (بـه اسـتثنايمونوباكتام ها) مؤثرند، مشكل عمده باليني به شمار مي روند. اين آنزيم ها به كاتيون هاي دو ظرفيتي ماننـد فلـز روي بـه عنـوانكوفاكتور براي فعاليت آنزيمي خـود نيـاز دارنـد (2و3). اولـينآنــزيم متالوبتالاكتامــاز شناســا يي شــده، IMP-1 در سراشــيا مارسـسنس در سـال 1991 بـود. در طـي دهـه اخيـر، انـواع MBLها از جمله GIM ،SPM ،VIM نيـز شناسـايي شـدهانـد
(1). پسودوموناس آئروژينوزاي مولـدMBL نيـز اولـين بـار درژاپن درسال 1991 گزارش گرديد و پس از آن، در آسيا، اروپا، استراليا و آمريكا نيز مشاهده شد (4و5). اولين سويه حاوي ژنblaVIM-1 نيز در ايتاليا در سال 1997 مشاهده شد (6). سومين عضو اين گروه، يعني SPM-1 در برزيل در سال 1997 و عضوديگر اين گروه تحت عنوان آنزيمGIM در سال 2002 از يـكنمونه كلينيكي در آلمان جداسازي شد (1و7).
متالوبتالاكتامازهــا توســط كلاوولانيــك اســيد و ســولباكتام و تازوباكت ام ك ه بازدارن ـده ه اي بتالاكتامازه ـا ه ـستند ، مه ار نمي شوند. بازدارنده هاي متالوبتالاكتامازها در محيط آزمايشگاه، شامل اتيلن دي آمـين تتـرا اسـتيك اسـيد (EDTA)، سـديممركاپتو استيك اسـيد (SMA)، 2 مركـاپتو پروپيونيـك اسـيد (MPA) و دي پيكولينيك اسـيد (DPA) هـستند . چنـد روشمختلف براي تـشخيص آزمايـشگاهي سـويههـاي مولـدMBL گ زارش ش ده اس ت. از جمل ه اي ن روش ه ا، اس تفاده از اي ن بازدارندهها است . در اين ميان، استفاده ازEDTA كـه مـاده اي غير سمي بوده و به راحتي قابل دسترسي است و ديسك هـايحاوي آن تا 16 هفته در دماي 20- درجـه سـانتيگـراد قابـلنگهداري هستند، نسبت به ساير بازدارندهها مناسـب تـر اسـت (8). استفاده از نوار Etest روش ديگر شناسـايي بـاكتري هـايمولدMBL است كه هزينه زيادي دارد و نتـايج حاصـل از آننيز از تكرارپذيري كمتري برخوردار است (9و10).
پسودوموناس آئروژينوزا از جمله باكتري هاي مقاوم بيمارستاني است كه به دليل كاهش نفوذپذيري دارو و توليد آنزيم هاي Amp C كروموزومي داراي مقاومت بالايي نسبت به آنتيبيوتيك هاست. استفاده از كرباپنمها در درمان عفونت هاي ناشي از باكتري هاي مقاوم به بتالاكتام ها، بسيار مفيد و مؤثر بودهاست. با اين وجود، مقاومت به كرباپنم ها در بين باكتري هايي چون پسودوموناس آئروژينوزا مشاهده شده است و به دليل اينكه ژن هاي آنزيم هاي MBL اكثراً روي اينتگرون كلاس 1 واقع شده اند، به راحتي بين سويه هاي مختلف انتقال مي يابند (11و12)، سويه هاي مولد MBL به دليل توانايي انتقال ژن ها به ساير باكتري ها و كلونيزه شدن طولاني مدت در بيمارستان ها تهديدي جدي در مراكز درماني بهشمار ميروند. تشخيص سريع اين سويه ها و گزارش دقيق حضور اين باكتري ها در بيمارستان ها مي تواند باعث كنترل بهتر و مؤثرتر انتشار اين سويه ها گردد. لذا هدف از اين پژوهش، بررسي حضور آنزيمهاي متالوبتالاكتاماز در سويه هاي پسودوموناس آئروژينوزاي مقاوم به ايمي پنم جمع آوري شده از بيمارستان امام خميني تهران و بررسي فراواني ژن هاي متالوبتالاكتاماز
.در اين ايزوله ها بود blaSPM-1 و blaVIM-1 ،blaIMP-1

مواد و روش ها
در طي سـال هـاي 1384 و 1385، 243 سـويه پـسودوموناسآئروژينوزا از بيمارستان امام خميني تهران، جمع آوري شـده وبــر اســاس اســتانداردهايCLSI ، بــا اســتفاده از روش هــاي بيوشيميايي از جمله رشد در محيط ستريمايدآگار، واكنش درمحيطTSI ، تست اكسيداز، كاتـالاز، بررسـي حركـت و توليـداندول در محيط SIM، رشد در 42 درجه سانتي گراد، شناسايي و تأييد شدند (13).
الكوي مقاومت آنتي بيوتيكي سويهها نسبت به آنتي بيوتيكهاي سفتيزوكسيم (ZOX)، آميكاسين (AN)، جنتامايسين (GM)، سيپروفلوكساسين (CIP)، پيپراسيلين (PC)، پيپراسيلين- تازوباكتام (Pt)، سفترياكسون (CRO)، سفوتاكسيم (CTX)، سفتازيديم (CAZ) و ايمي پنم (IMP) (تهيه شده از شــركت MAST, Merseyside, UK) به روش انتشار در آگار (Kirby-Bauer) بررسي شد. سپس، MIC سويههاي غير حساس به سفتازيديم و ايمي پنم، با استفاده از روش Microbroth dilution با تـوجه به پروتـكل CLSI تـعيـين گرديد. از سـويه P. aeruginosa ATCC 27853 براي كنترل روشهاي آنتيبيوگرام و MIC استفاده شد. در نهايت، حساسيت سويه هاي دارايMIC≥4 µg/ml نسبت به ايميپنم، كليستين و پلي ميكسين B تعيين گرديد.
سويههاي دارايMIC≥4 µg/ml نسبت به ايمـي پـنم بـا روش ( Double Disk Synergy Test (DDSTبا اسـتفاده ازEDTA به عنوان مهاركننده آنزيم هايMBL به منظور بررسـي توليـداين آنزيمها مورد بررسي قرارگرفت نـد. بـه ايـن صـورت كـه دوديــسك ايمــيپــنم و ايمــيپــنم حــاوي 930 ميكروگــرم EDTA 0/5 M در پليت حاوي مولر هينتون آگار كـشت دادهشده با باكتري بـا كـدورتMcFarland 5/0 قـرار داده شـد و پس از انكوباسيون در دماي 37 درجه سانتيگـراد، قطـر هالـهعدم رشد اطراف دو ديسك اندازه گيري شد . تفاوت هالـه عـدمرشد در اطراف دو ديسك اگر برابر يا بيشتر از 7 ميليمتر بـود، باكتري مولدMBL گزارش ميشـد (8). از آنجـا كـه ژنهـايMBL بيشتر پلازميدي هـستند (14) جهـت اسـتخراجDNA پلازميدي سويهها از كيـت اسـتخراج پلازميـد (تهيـه شـده ازشركت (Fermentas, Vilnius, Lithuania) استفاده شد. آزمـون PCR نيز براي بررسـي فراواني ژنهاي متالوبتالاكتاماز blaIMP-1 ،blaVIM-1 و blaSPM-1 در سويه هاي داراي MIC≥4 µg/ml نسبت به ايمي پنم با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي اين ژن ها و برنامه PCR كه در جدول 1 آورده شدهاست، انجام شد (7و15). يك ميكروليتر از DNA پلازميدي استخراج شده به PCR master mix با حجم نهايي μl 25 (هر ويال محتوي 5/1 ميلي مول از 2MgCl و 24/.
ميلي مـول از dNTPs و 5 پـيكومـول از هــر پـرايـمـر و يك واحـد آنــزيـم Taq polymerase) اضافـه گــرديـد. از سـويـه P. aeruginosa Po510 مولد VIM-1 (16) و سويه 61 P. aeruginosa مولد SPM-1 (17) براي كنترل در آزمون PCR استفاده گرديد. از ماركر 100 bp ladder (Fermentase) نيز براي تأييد وزن مولكولي محصولات تكثير شده استفاده شد. الكتروفورز نمونه ها در ژل 1% آگارز انجام شده و پس از رنگ آميزي با اتيديوم برومايد، نتايج، با دستگاه Vilber Lourmat, France) Gel Documentation) با نور ماوراي بنفش (UV) مشاهده شد.

يافته ها
از 243 سويه پسودوموناس آئروژينوزا ي جمع آوري و ت أييدشده به روشهاي بيوشيميايي در اين مطالعه، 64 سويه مربوط به نمونه هاي تنفس، 90 سويه مربوط به زخم، 32 سويه مربوط به ادرار، 19 سويه مربوط به خون، 3 سويه مربوط به مدفوع، 1 سويه مربوط به گوش، 3 سويه مربوط به چشم و 31 سويه مربوط به ساير موارد بود. كمترين و بيشترين مقاومت به ترتيب مربوط به ايميپنم (9%) و سفتيزوكسيم (97%) بود. مقاومت به سفتازيديم نيز در 42% سويه ها مشاهده شد. ميزان مقاومت به آميكاسين (35%)، پيپراسيلين- تازوباكتام (5/34%)، سيپروفلوكساسين (41%)، جنتاما سين (42%)، سفتازيديم (42%)، پيپراسيلين (55%)، سفترياكسون (5/66%) و سفوتاكسيم (70%) بود. از مجموع نمونههاي مورد مطالعه، 34 سويه با روش انتشار در آگار نسبت به ايمي پنم غيرحســـاس (مقاوم و حد واســط) بودنــد كه از اين ميـــان، 28 سويه، MIC≥4 µg/ml نسبت به اين آنتي بيوتيك
جدول 1- توالي پرايمرها و دماهاي مورد استفاده در آزمون PCR ژن هاي blaSPM-1 ،blaIMP-1 ،blaVIM-1
PCR
Primer Name
Sequence (5’ to 3’)
Denaturation
Annealing
Extension
Cycles
Gene
(
Product Size)

PCR

Primer Name

Sequence (5’ to 3’)

Denaturation

Annealing

Extension

Cycles

Gene

(

Product Size)

blaVIM-1
VIM-1 AGTGGTGAGTATCCGACAG
ATGAAAGTGCGTGGAGAC (261 bp)
94ْ C 55ْ C 72ْ C blaIMP-1 IMP-1 ACC GCA GCA GAG TCT TTG CC 30
ACA ACC AGT TTT GCC TTA CC 1 min 1 min 1.5 min (587 bp)
blaSPM-1
SPM-1 GCG TTT TGT TTG TTG CTC
TTG GGG ATG TGA GAC TAC (786 bp)

شماره 2، پي در پي 68، خرداد و تير 1388 دكتر فرشته شاهچراغي و همكاران/ 69
نشان دادند. از اين تعداد، 16 نمونه تنفسي و 7 نمونه از عفونت هاي زخمي و بقيه از ساير عفونتها مانند ادرار و نمونههاي بافتي جدا شده بود. تمامي اين 28 سويه به منظور تشخيص سويههاي مولد MBL به روش DDST بررسي شدند كه 78% (22 سويه) از آنها MBL مثبت بودند. نتايج حاصل از آزمون PCR نيز نشان داد كه 15 سويه از 28 سويه مورد بررسي (54%)، حاوي ژن 1blaVIM- بودند (شكل1) كه 10 سويه از آنها از نمونه هاي تنفسي و 5 سويه از عفونت هاي زخم بودند.

شكل 1- الكتروفورز ژل آگارز محصول PCR ژن1-blaVIM

MIC ايمي پنم يك سويه، 8؛ 10 سويه، 16؛ و 4 سويه، 32 ميكروگرم بر ميليليتر بود. از اين 15 سويه، 12 سويه به روش DDST مولد آنزيم MBL بوده كه با نتايج PCR مطابقت داشت. تنها 3 سويه با اين روش منفي شدند. اين 15 سويه نسبت به ساير آنتي بيوتيكهاي مورد مطالعه مقاومت نشان دادند. اما تمامي سويهها نسبت به كليستين و پلي ميكسين B حساسيت نشان دادند. با توجــه به نتايج به دســت آمده ژنهاي blaIMP-1 وblaSPM-1 در هيچكدام از سويه هاي مورد بررسي، مشاهده نشد.

بحث
متالوبتالاكتامازها به دليل ايجاد مقاومت به كرباپنم ها كه از مؤثرترين آنتي بيوتيك هاي مورد استفاده عليه عفونت هاي پسودومونايي هستند، بسيار حائز اهميت مي باشند. به دليل مقاومت بالاي باكتري هاي مولد اين آنزيم ها و شكست آنتي بيوتيكدرماني و ايجاد عفونت هاي شديد مانند سپتي سمي و پنوموني، خطر مرگ و مير ناشي از حضور اين سويه ها نسبت به ساير باكتريهاي مقاوم به ايمي پنم در عفونت هاي بيمارستاني بيشتر است (11). بررسي و تشخيص سريع اين آنزيمها در باكتريهاي مقاوم به كرباپنم ها به ويژه ايمي پنم هم از لحاظ اپيدميولوژيك و هم به منظور كمك به پزشكان معالج در انتخاب آنتي بيوتيك مناسب براي درمان موفق بيماران و نيز براي كنترل سويههاي مقاوم به داروها و جلوگيري از انتشار چنين عفونت هايي در بيمارستان ها لازم به نظر ميرسد. از آنجا كه ژنهاي اين آنزيمها در عناصر قابل انتقال از جمله پلازميدها و اينتگرون ها واقع شدهاند، به راحتي ميتوانند بين سويه هاي مختلف يك باكتري و حتي باكتري هاي مختلف انتقال يابند؛ به طوري كه در مطالعه اي كه در بيمارستانهاي ژاپن، ايتاليا و كلمبيا انجام شده است، بدون مصرف قبلي كرباپنمها نيز پسودوموناس هاي مولد IMP و VIM مشاهده شده است كه بيانگر انتقال اين ژن بين سويه هاي مختلف است (11و12و17). سويه هاي داراي اين ژن ها به دليل پيوستگي ژنتيكي، به خانواده مختلف آنتي بيوتيك ها از جمله سولفاناميدها، كينولون ها و آمينوگليكوزيدها نيز مقاومت نشان ميدهند (1). از طرف ديگر مكانيزم هاي ديگر شايع در پسودوموناس آئروژينوزا مانند efflux pumps و AmpC كروموزومي نيز مي تواند به طور هم زمان در ايجاد مقاومت اين باكتري به آنتيبيوتيك هاي مختلف نقش داشته باشد. نتايج حاصل از اين بررسي نيز نشان مي دهند كه 13 سويه از 15 سويه VIM مثبت به روش PCR مقاومت 100% به آنتي بيوتيك هاي مورد مطالعه، نشان دادند. اما خوشبختانه تمامي اين سويه ها به كليستين و پليميكسين B حساسيت نشان دادند.
تاكنون روش هاي مختلفي براي شناسايي سويه هاي مولد آنزيمهاي MBL به كار رفته است. در اين بررسي نيز از EDTA كه يك بازدارنده متالوبتالاكتامازي است، براي تشخيص به روش DDST استفاده شد. استفاده از اين روش، ساده بوده، به راحتي قابل تفسير است و مشكلات ساير بازدارنده هاي MBL مانند سمي بودن 2- مركاپتو پروپيونيك اسيد، گران بودن قيمت



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید