تاريخ دريافت مقاله ۱۱/۹/۸۶ تاريخ پذيرش مقاله ٢٠/٢/٨٧ پژوهن ده (مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهي د بهشتي) سال سيزده م, شماره ۳ , پي در پي ۶۳ ، صفحات ۲۳۱ تا ۲۳۷
مرداد و شهريور ۱۳۸۷

فراواني پاپيلوما ويروس انساني در زنان مبتلا به کانسر سرويکس با روش PCR
دکتر گيتا اسلامي١ ٭، مري م گل شني٢ ، دکتر مح مد رخ شان٣، دکتر فاط مه فلاح٤، دکتر حسين گودرزي ٤

چکي ده
سابقه و ه دف: سرطان سرويکس دومين سرطان شايع در ميان زنان، در سراسر جهان بوده و همچنين رتبه دوم مرگ و مير در ميان سرطان ها، به خصوص در سنين بين ٦٥‐٢٥ سال، دارد. براي ايجاد سرطان سرويکس يک سري تغيرات سلولي لازم است تا يک ديسپلازي به کارسينوماي مهاجم تبديل شود و از آن جايي کهHuman Papilloma virus) HPV ) ژنيتال داراي
انکوژن هاي (E6 وE9) لازم براي ايجاد اين تغييرات در اپيتليوم سرويکس مي باشد، امروزه HPV به عنوان مهم ترين و اصلي ترين ريسک فاکتور ايجاد سرطان سرويکس شناخته شده است. اعتقاد بر اين است که HPV در صورت همراهي با ساير ريسک فاکتورها مثل استعمال دخانيات، مصرف داروهاي ضد بارداري، ضعف سيستم ايمني و غيره منجر به افزايش ميزان پيشرفت و گسترش سرطان سرويکس می شود.
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:12 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:12 +0330 on Wednesday January 10th 2018

مواد و روش ها: در اين مطالعه، بلوک هاي بيوپسي سرويکس ٧٠ زن مبتلا به سرطان سرويکس با استفاده از روش PCR از نظر وجود HPVبررسي شدند. تايپينگ نمونه هاي مثبت از نظر تيپ هاي شايع و پرخطر HPV با استفاده از روش PCR انجام گرفت.
يافته ها: از ميان اين تعداد بيماران، ٤٩% HPV مثبت بودند و HPV16شايع ترين تيپ HPV جدا شده از موارد مثبت بود. بررسي نتايج حاصل از طبقه بندي سني بيماران حاکي از آن بود که گروه سني ٤٤‐٣٥ بيش ترين درصد موارد HPV مثبت را به خود اختصاص داده بودند.
نتيجه گيري: با توجه به شيوع عفونت HPV در ميان زنان جوان مبتلا به سرطان سرويکس و وجـود دوره طولاني مـدت Premalignant در سرطان سرويکس، بررسي تمام زنان بالاي ٢٠ سال از نظر سيتولوژيک و هم چنين بررسي موارد مشکوک از نظر وجود پاپيـلوما ويروس انساني پيشنهاد مي شود.
واژگان کلي دي: HPV ، سرطان سرويکس ، بيوپسي ، PCR

مق دمه
متعددي در ايجـاد و يـا پيـشرفت سـرطان سـرويکس بيـان Kessler در سال ٨١‐١٩٧٦ بـا بررسي و مقايسـه بيـماران

۱ ٭ . نويسنده مسؤول : دانشيار ، گروه ميکروب شناسي ، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي . آدرس بـراي مکاتبـه : تهـران ، اوين ، خيابان تابناك ، جنب بيمارستان آيت ا… طالقاني ، دانشکده پزشکي ، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي . تلفن : ٢٣٨٧٢٥٥٦. دورنما : ٢٢٤٢٤٢٠٦ . پست الکترونيک: [email protected] yahoo.com
٢ . کارشناس ارشد ميکروب شناسی ، گروه ميکروب شناسي ، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
۳ . استاد ، گروه آسيب شناسی ، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
. دانشيار ، گروه ميکروب شناسي ، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
. دانشيار ، گروه ميکروب شناسي ، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
سرطان گردن رح م دومين سرطان شايع در ميـان زنـاندر سراسر جهان و ه م چنين دومين عامل سـرطاني کـشندهبا سالانه ٥٠٠ هزار مورد مرگ و مير، خصوصاﹰ در کـشورهايدر حال توسعه، به شمار م ي آيد (١و٢). امروزه عوامـل خطـر
شده اند که از ميان آن هاHPV به عنوان عمده ترين عاملخطر شناخته شده است (٣‐١). اولين بـارRigoni-Stezn در سال ١٨٤٢ نشان داد که ميزان کارسينوماي سرويکس درزنان متأهل و بيـوه بـيش از زنـان مجـرد اسـت. هـ م چنـين
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:12 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:12 +0330 on Wednesday January 10th 2018

۲۳۲
ســرطاني بــا گــروه کنتــرل نــشان داد ک ه خطــر ابــتلا بــه کارسينوماي گردن رح م در زناني که شوهران آن ها قـبلاﹰ بـازن مبتلا به کارسينوماي سرويکس ازدواج کرده بودند، خيليبيش تر است . نهايتاﹰ در دهه ١٩٨٠ نقشHPV مقـاربتي درايجـاد تغييـرات پـري کانـسر و کانـسر اپيتليـوم سـرويکس ثابت شد (٤). امروزه با بررسي سلول هايHella که از يـکزن مبتلا به سـرطان سـرويکس بـه دسـت آمـده، ٧٠ تيـپمختلف از HPV آشکار شـده اسـت. در حـال حاضـر نقـشHPV ب هعنوان يـک عامـل شـايع در ايجـاد بيمـاري هـايمقاربتي در ميان افراد فعال جنسي (٢٠ ميليون مورد آلودگي بهHPV در هر سال در آمريکا) و همين طـور عامـل ايجـادسرطان هاي مقعدي تناسـلي (خـصوصاﹰ سـرطان سـرويکس) پذيرفته شده است (١و٢و٥).
وقوع و شيوع عفونتHPV در زنـان در سـنين زيـر ٢٥ سال بيش ترين ميزان خود را داشته و دومين پيـک عفونـت
بـا HPVبعـد از سـن ٤٠ سـالگي مـشاهده مـي شـود کـه دليل ايـن افـزايش و کـاهش حـساسيت در سـنين مختلـفمشخص نيست (٦). ساير عوامل خطري که در ايجاد سرطانسرويکس نقش دارند، وقتي باHPV بـه عنـوان يـک عامـلاساسي همراه شوند، گسترش سرطان را تسريع مـي نماينـد.
اين عوامل شامل: سـن (اغلـب مـوارد سـرطان سـرويکس درسنين بالاي ٤٠ سال رخ مي دهد)، عدم انجام مـنظ م تـستپاپ اسمير، ضعف سيست م ايمني (زنان آلوده بـهHIV و يـادريافت کنندگان داروهاي ايمونوساپرسيو)، استعمال سـيگار،رژي م غذايي نامناسب، تاريخچه تماس هاي جنـسي (داشـتنشرکاي جنسي متعدد يا تماس جنسي با کسي کـه شـرکايجنسي متعددي داشته)، اسـتفاده از داروهـاي ضـد بـارداريخوراکي (بيش از ٥ سال )، زايمان هاي متعدد و نهايتاﹰ سـطحپايين فولات سرم مي باشند (٣و٤).
عفونت مجاري ژنيتال زنان کـه بـه وسـيلهHPV ايجـاد مي شود، باCIN و سرطان سـرويکس در ارتبـاط اسـت. بـامشخص شدن نقشه ژنوميHPV انکوژن هايي در 16HPV و 18HPV کشف شد که محصول بيان آن ها پروتئين هـاي6E و 7 Eمي باشند. امروزه شايع ترين تيپ هاي HPV کـهدر نئوپلازي اينترا اپيتليال سرويکال وSCC يافت مي شـوند، 16HPV و 18HPV هــستند کــه در ســال ١٩٩٥ از طــرف آژانس بين المللي تحقيقـات کانـسر بـهعنـوان کارسـينوژنانساني ثبت شده اند. طبـق مطالعـات صـورت گرفتـه HPV تيپ هاي ١٦و١٨و٣١و٣٣و٤٥ به عنوان شايع ترين تيپ هاي مــرتبط بــا کارســينوماي ســرويکس شــناخته شــده انــد وmRNA ژن هـاي 6E و 7 Eآن هـا در بيمـاران مبـتلا بـهکارسينوماي سرويکس کشف شده است (١و٢و٥و٧). سرطان مهاج م سرويکس با يک فاز طولاني مـدتPremalignant شروع مي شود که قابل درمان مي باشد. بعـد از ايـن مرحلـهحتي در صـورت پيـشرفت بيمـاري بـه طـرف مرحلـه اوليـه(Early stage)، باز ه م بيماري در٩٠% موارد قابـل درمـاناست. اما اگر بيماري بـه خـارج از لگـن انتـشار يابـد، ميـزانموفقيت درمان ١٥‐١٠٪ خواهد بود (٦).
فـاز تغييـرات پـيش سـرطاني و مراحـل اوليـه سـرطان سرويکس معمولا فاقد علاي م باليني يا درد مي باشـد. امـا بـاپيشرفت بيماري علاي م باليني کانسر سرويکس شامل: وجـودترشحات واژينال صورتي رنگ بدون بو، خونريزي غيـر عـاديواژينــال (خــون ريــزي در فاصــله بــين دو عــادت ماهيانــه،خونريزي بعد از مقاربت، عادت ماهيانه طولاني تر، خـونريزيبعــد از يائــسگي )، درد در زمــان مقاربــت و درد در نــواحي
پراکنــدگي عــصب ســمپاتيک (پــشت باســن، ران و زانــو ) ظاهر مي شوند (٣و٨).
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:12 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:12 +0330 on Wednesday January 10th 2018

از آن جايی که زنان بين ٦٥‐٢٠ سال بيش تر در معـرضخطر سرطان سرويکس مهاج م بوده و مرگ و مير ناشی از آن در اين افراد بالاست (٩٠%) و ه م چنين بـيش تـرين مـواردکانسر مهاج م در زناني رخ مي دهد که هرگز و يـا حـداقل ٥ سال قبل تست پاپ اسمير نداشته اند، بنابراين انجـام تـستپاپ اسمير به طور روتين هر ٢ سال يکبار بـراي تمـام زنـانبالاي ٣٠ سال الزامی است (٥و٦ ). HPV در کشت سلـولي قادر به رشد نيست و تست هـاي آنتـي بـادي هـ م در مـواردمحدودي تنها در آزمايشگاه هـاي تحقيقـاتي موجودنـد، لـذابـراي تـشخيص HPV در نمونـه سـرويکال از پـاپ اسـمير استفاده مي شود و تغيـرات سـلول سـرطاني در نمونـه پـاپاسمير شامل رنگ پذيري نامناسب، پلي مورفيس م، بي نظميهسته، هايپرکرومـازي، وجـود چنـد هـسته، افـزايش حجـ مسيتوپلاس م‐ هسته و وجودkoilocyte می باشد. بـا انجـاممنظ م تست پاپ اسمير و کشف سلول هاي تغيير شکل يافتهتوسطHPV و درمان آن ها با روش هاي فريزينگ، سوزاندنيا درمان دارويي مي توان از پيشرفت اين تغييرات بـه سـمتسرطان جلوگيري نمود. البته امروزه به کمـک علـ م بيولـوژيمولک ولي، اثب ات وج ود HPV در نمون ه س وآپ ي ا باف ت سرويکال با استفاده از انواع روش هايPCR و پـروب هـايDNA امکان پذير شده است (٢و٣و٥).
خطرنــاک و برگــشت ناپــذير عفونــت هــاي ژنيتــالHPV ٥ ميکروليتــر از PCR-mix-1، ١٠ ميکروليتــر از 2.5X
،Hot Start Polymerase ميکروليتر از ٠/٥ ،buffer-red
١٥ ميکروليتر از Reaction Mix، ١ قطره از روغن معدني و ١٠ ميکروليتر ازDNA نمونه باليني بود. واکنش براي ٤٢ سيکل و تحت شرايط ذيل انجام گرفت: ١٥ دقيقه درºC ٩٥، ٣٠ ثانيه درºC ٩٥، ٣٠ ثانيه درºC ٦٣، ٣٠ ثانيـه درºC ٧٢و
١ دقيقه درºC ٧٢. در نهايت آشکارسـازي و عکـس بـرداريمحصولاتPCR زير نورUV ، پس از الکتروفورز محصولاتب ه مــدت ٤٥ دقيق ه بــر روي ژل آگ ارز ٢٪ حــاوي ١‐٥/٠ ميکروگرم در ميلي ليتر اتيديوم برومايد انجام گرفت. در ايجاد سـرطان سـرويکس و گـسترش آن، مطالعـه حاضـر به بررسی نمونه بيوپسي سرويکس زنـان مبـتلا بـه سـرطانسرويکس از نظر وجود HPVو آشکار سازي سروتايپ هـايپرخطر آن با روش PCR پرداخته است.
مواد و روش ها
در اين مطالعه توصـيفي نمونـه هـاي بيوپـسي پارافينـهتعــداد ٧٠ نفــر از بيمــاران مبــتلا بــه ســرطان ســرويکس (Squamous Cell Carcinoma (SCC کـه در فاصـله
ســال ٨٦‐٨٤ بــه بخــش پــاتولوژي بيمارســتان طالقــاني جهت تايپينگ نمونه هاي مثبت از نظر وجود تيپ هـاي
با توجه به مطالـب ذکـر شـده و عـوارض شـديد و بعـضاﹰحاوي نمونه بيوپسي تهيه شد. سپس پـارافين اطـراف نمونـه
توســط تيــغ برداشــته و پــارافين باقيمانــده طــي مراحلــي با استفاده از گزيلن و الکل اتيليک حذف شد. در مرحله بعـد،استخراجDNA از نمونه بافـت بـا اسـتفاده از کيـتDNP (ساخت کمپاني سـيناژن بـا شـماره اتـالوگ DN8115C ) انجام گرفت . در نهايتDNA استخراج شده تا زمـان انجـامآزمايش PCR در فريزر ٢٠‐ نگه داري شد.
جهت بررسي وجودHPV در نمونه هاي بيوپسي از کيتHPV Screening (سـاخت کمپـاني Sacace ايتاليـا بـا شماره کاتالوگV-26-50R ) استفاده شـد کـه يـک تـست
آمپيليفيکاسيون اسيد نوکلئيـک جهـت آشکارسـازي کيفـي HPV در نمونه هاي باليني اسـت. در ايـ ن تـست هـر لولـه
PCR-mix-1 حاوي پرايمرهاي اختصاصي ضد گـروه هـايHPV A6 , A7 , A9 و ژن بتاگلوبين، بـ ه عنـوان کنتـرلداخلي است. اين واکنش در حج م ٥/٤٠ تهيه شده و حـاوي:
مراجعه نموده بودند، اخذ گرديد. اسلايدهاي پاتولوژي از نظروجــود ســرطان ســرويکس مــورد بررســي مجــدد و تأييــد پاتولوژيست قـرار گرفتنـد. عـلاوه بـر ايـن، مـدارک پزشـکيموجود براي دستيابي به اطلاعات باليني و شخـصي بيمـارانمورد مطالعه قرار گرفت.
براي استـخراج DNA ابتـدا برش نازکي از بلوک پارافينه HPV High risk از کيــت HPV Typing (ســاخت کمپانيSacace ايتاليـا بـا شـماره کاتـالوگV-25-50R ) استفاده شد که يک تست آمپيليفيکاسـيون اسـيد نوکلئيـک
جه ت تايپين گ کيف ي HPVاز نظ ر وج ود تي پ ه اي ١٦،١٨،٣١،٣٣،٣٥،٣٩،٤٥،٥٢،٥٦،٥٨،٥٩،٦٦ در نمونه هـايباليـني است. در اين تسـت هر لولـه PCR-mix-1 حـاوي Mix Reaction، ١ قطره از روغن معدني و ١٠ ميکروليتر ازDNA نمونه باليني بود. واکنش براي ٤٢ سـيکل و تحـت
شرايط ذيـل انجـام گرفـت: ١٥ دقيقـه درºC ٩٥، ٣٠ ثانيـه در ºC ٩٥، ٣٠ ثانيه در ºC ٦٣، ٣٠ ثانيه در ºC ٧٢ و ١ دقيقه درºC ٧٢. در نهايت آشکارسازي و عکس برداري محـصولاتPCR زير نورUV ، پس از الکتروفورز محـصولات بـه مـدت
٤٥ دقيقـه بـر روي ژل آگـارز ٣٪ حـاوي ١‐٥/٠ ميکروگـرم در ميلي ليتر اتيديوم برومايد انجام گرفت.
يافته ها
در اين مطالعه نمونه بيوپسي پارافينه ٧٠ بيمـار مبـتلابهSCC از نظر وجود ژنـومHPV و نـوع تيـپ آن مـوردارزيابي قرار گرفت. معدل سني بيمـاران ٥/٤٦ سـال (بـين٦٥‐ ٢٥ سال ) و بـيش تـرين مـواردHPV مثبـت متعلـق به گروه سني ٤٤‐ ٣٥ بود (جدول١). علاي م بـاليني شـاملترشحات واژينال خونريزي و غيـر عـادي واژينـال در اکثـربيماران مشاهده شد.
جدول ١ ‐ توزي ع سني زنان مبتلا به کانسر سرويکس مراج عه کننده به مراکز درماني بر اسا س نتيجه PCR
منفي مثب ت نتيجه تس ت
سن بيماران
درص د تعداد درص د تعداد ٣٣/٣٣ ١٢ ١٤/٧١ ٥ ٢٥‐ ٣٤
٥٠ ١٨ ٧٣/٥ ٢٥ ٣٥‐ ٤٤
٨/٣٣ ٣ ٣ ١ ٤٥‐ ٥٤
٨/٣٣ ٣ ٨/٨ ٣ ٥٥<
جمع٣٤

٤٩

٣٦

٥١

٣٤

٤٩

٣٦

٥١

۲۳۴
پرايمرهاي اختصاصي ضد ٤ تيپHPV و ژن ب تـا‐گلـوبين، از نمونه های مورد مطالعه، ٣٤ مورد (٤٩%) از نظر HPV بهعنوان کنترل داخلي، است. ايـن واکـنش در حجـ م ٥/٤٠ مثبت بودند که شامل تيپ ١٦ (٢١ مورد)، ١٨ (٤ مورد) و تهيـــه شـــده و حـــاوي: ٥ ميکروليتـــر از PCR-mix-1 ، تيپ هاي ٣١، ٣٣، ٤٥ و ٥٢ (جمعاﹰ ٩ مورد) بود (جدول ١).
١٠ ميکروليتـ ر از 2.5X buffer-red ، ٥/٠ ميکروليتـ ر از Hot Start Polymerase ، ١٥ ميکروليتــــر از بح ث
کانسر سرويکس رح م دومين سرطان شايع و کـشنده درميان زنان، به خصوص در کشورهاي در حال توسعه محسوبمي شود . عوامل خطر متعددي در ايجـاد و يـا پيـشرفت ايـنسرطان بي ان شده انـد کـه از ميـان آن هـا پاپيلومـا ويـروسانساني ب هعنوان مه م ترين عامل مـؤثر در ايجـاد و پيـشرويکارسينوماي سرويکس شناخته شده است (٣‐١).
در ايـن مطالعـه، از ميـان ٧٠ بيمـار مبـتلا بـه سـرطان ســرويکس ٤٩٪ دارای HPV بودنــد کــه در مقايــسه بــا يافته هاي مطالعات انجام شـده در سـاير نقـاط جهـان مثـلايتاليا (٨٠٪)، برزيل (٩٦٪)، کرواسـي (٩٣٪)، يونـان (٧٤٪)، سريلانکا (٧٣٪) و حتي کشورهاي آسيايي و ه م جـوار ايـرانمثل هنـد (٩٥٪)، ليتـواني (٩٢٪)، چـين (٨٣‐٧٥٪)، ژاپـن(٨٧٪) و کــره (٩٠٪)، ايــن درصــد کــ م تــر مــي باشــد
(٢٢‐٩). در توجيه اين تفاوت مي توان به وجود جو مـذهبيدر کشور ايران اشاره نمود که با توجه بـه پـاي بنـدي مـردم به اصول اخلاقي و مذهبي، ميزان شيوع عفونت هاي منتقـلشـونده از راه جنـسي کـه عفونـت HPV هـ م جـزو آن هـا به شمار مي رود، در ميان ملت هاي مسلمان کـ م تـر اسـت.
از ميان کشورهاي ه م جوار ايران، تنها در کشور ترکيه ميزانموارد مثبتHPV کـ م تـر از يافتـه هـاي مطالعـه مـا بـود (١٥‐٧٪) که اين مـسأله مـي توانـد ناشـي از عـدم توجـه ومراجعه منظ م زنـان ايرانـي جهـت انجـام معاينـات سـالانه و ه م چنين بيش تر بودن جمعيت کشورمان باشد (٢٣و٢٤).
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:12 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:12 +0330 on Wednesday January 10th 2018

نت ايج حاصــل از تايپيـــنگ نمونــه هــاي HPVمثبــت نشان دهنده آن بود کهHPV16 شايع ترين تيپ جدا شدهاز بيمـاران مبـتلا بـه سـرطان سـرويکس اسـت. ايـن يافتـه موافـق با يافتـه هاي محـققاني ه م چونTornesello ML

1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:12 +0330 on Wednesday January 10th 2018



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید