تاريخ دريافت مقاله ۲۸/۱۱/۸۵ تاريخ تجديد نظر ١٣/٥/٨٦ تاريخ پذيرش مقاله ٦/٦/٨٦ پژوهن ده (مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهي د بهشتي)
سال دوازده م, شماره ۴, پي در پي ۵۸ ، صفحات ۲۷۳ تا ۲۸۱
مهر و آبان ۱۳۸۶

بررسي نقش هورمون هاي استروئي دي جنسي گنادال بر بيان ژن 2GIRK در نخاع موش صحرايي
دکتر ن ع م ت اﷲ آهنگر ، دکتر بهرا م کاظ مي ، دکتر م عصومه جرجاني ۳ *

چکي ده
سابقه و ه دف: مطالعات متعـددي وجـود دارد که تفاوت بين دو جنس نر و ماده را در پاسخ به درد و اثرات ضد دردي داروهاي اپيوئيـدي نشان مي دهد. در اغلب موارد، اپيوئيدها در جنس نر داراي اثرات ضـد دردي بيش تري نسبت به جنس ماده بوده اند.
در اين مطالعه، ما تأثير هورمون هاي استروئيدي گنادال را بر بيان ژن 2GIRK ، ااِفِفکتور پس سيناپسي اصلي و مهم داروهاي اپيوئيدي در سيستم عصبي مرکزي، بررسي نموديم.
مواد و روش ها: اين مطالعه بر روي موش هاي صحرايي نر و ماده نژادWistar در گروه هاي بالغ و نوزاد صورت گرفت. حيوانات بالغ خود شامل زيرگروه هاي دست نخورده، GDX+Testosterone، Sham ،GDX بودند. از تکنيک RT-PCR نيمه کمي، جهت تعيين بيان ژن 2GIRK در بافت نخاعي حيوانات استفاده شد.
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:13 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:13 +0330 on Wednesday January 10th 2018

يافته ها: بر اساس نتايج حاصله، در جنس نر بيان ژن 2GIRK در بافت نخاعي حيوانات نابالغ ( نوزاد) با ميزان بيان اين ژن در حيوانات بالغ دست نخورده يا گنادکتومي شده تفاوتي نداشت. حذف هورمون هاي گنادال در گروه نر مشخصاﹰ موجب کاهش ميزان بيان اين ژن گرديد. اين تغييرات با جانشين درماني حيوان تستکتومي شده با تستوسترون به حالت اوليه باز نگشت. اما در جنس ماده بيان ژن 2GIRK در حيوانات بالغ، اعم از دست نخورده يا گنادکتومي شده در مقايسه با حيوانات نابالغ (نوزاد) بسيار بالاتر بود. اواريکتومي حيوان ماده تغيير قابل توجهي در سطوح mRNA ژن 2GIRK ايجاد ننمود. همچنين هيچ گونه تفاوت جنسي در بيان ژن مذکور بين گروه هاي بالغ دست نخورده، و نابالغ (نوزاد) مشاهده نشد.
نتيجه گيري: به نظرمي رسد تنظيم نسخه برداري ژن 2GIRK در جنس نر بيش از جنس ماده تحت تأثير هورمون هاي گنادال قرار مي گيرد در حالي که در جنس ماده ساير فاکتورهاي تکاملي و تغـييرات دوره بلـوغ روي بيان اين ژن تأثيـرگذار مي باشند.
مطالعات بيش تري براي روشن شدن مکانيسم دقيق اين تغييرات بايستي انجام گيرد.
واژگان کلي دي: 2GIRK ، هورمون هاي استروئيدي گنادال ، تفاوت جنسي ، RT-PCR ، موش صحرايي

مق دمه
شواهد بسيار زيادي وجود دارد که نشان دهنده تفاوت دو جنس نر و ماده را در پاسخ به درد و اثر ضد دردي داروهاي اپيوئيدي بر روي آن ها است. در اغلب مطالعات باليني، آستانه درد در خانم ها پايين تر از آقايان بوده و داروهاي ضد درد اپيوئيدي اثر بخشي متفاوتي را در خانم ها و آقايان بروز داده اند (۵‐۱). اين تفاوت جنسي در حيوانات آزمايشگاهي و از جمله در جوندگان نيز مشاهده شده است. به عنوان مثال، اثر ضد دردي مرفين در موش سوري و موش سفيد آزمايشگاهي نر، به ميزان معني داري بيش تر از جنس ماده بوده است (۶و۷). فاکتورهاي متعددي از عوامل رواني‐ اجتـماعي تا عوامل فيـزيولـوژيک، در بروز اين تفـاوت ها نقـش دارند (۸ و۹).
در سال هاي اخيـر، بيـش ترين توجـه به نقش هورمون هاي استروئيدي جنسي معطوف بوده است (۱۳‐۱۰). تفاوت جنسي در پاسخ دهي به اثرات ضد دردي اپيوئيدها، عمدتاﹰ ناشي از نقش تعديل کننده هورمون هاي استروئيدي جنسي، چه به صورت ساختاري و چه به صورت عملکردي مي باشد (۱۴و۱۵). در مورد اثرات ساختاري، عقي م سازي نرها و تزريق تستوسترون به جنس ماده در نوزاد موش سفيد آزمايشگاهي، سبب حذف اين تفاوت اثر مرفين شده است (۱۴). اما در مورد نقش عمـلکردي هورمون هاي استروئيدي جنسي در حيوانات بالغ، نتايج ضد و نقيضي ارائه شده است (۸). همچنين مطالعاتي که حذف گنادها و به دنبال آن جايگزيني هورمـون هاي استروئيـدي جنـسي را در موش صحرايي بالغ انجام داده اند، نتايج متغيري گزارش کرده اند (۸). اگرچـه مکانيس م هايي که سبب بروز اين تفاوت ها مي شود، هنوز کاملاﹰ شناختـه نشـده اند، اما به نظر مي رسد که تفاوت در اجزاي سلولي مسيرهاي نشانه پردازي اپيوئيدها، مي تواند به عنوان يک عامل مه م در بروز اين تفاوت جنسي تلقي گردد (۲۰‐۱۶).
مسيرهاي نشانه پردازي اپيوئيدها مشتمل بر مسيرهاي پيش سيناپسي و پس سيناپسي مي باشد که مهم ترين آن ها شامل مهار آزاد سازي واسطـه هاي عصبي از طريق مـهار کانال هاي کلسيمي وابسته به ولتاژ و فعال شدن کانال هاي پتاسيمي وابسته به ولتاژ در نورون پيش سيناپسي و کاهش تحـريک پذيري نروني از طريق فعـال کـردن کانال هاي پتاسيمي متصل به پروتئين G موسوم به GIRK در نورون پس سيناپسي مي شوند (۲۱و۲۲). چهار زير واحد تحت عنوان 1-4GIRK براي GIRK در پستانداران شناسايي شده است که از بين اين ها 2GIRK به عنوان ِاِفکتور پس سيناپسي اصلي اپيوئيدها در سيست م عصبي مرکزي مطرح مي باشد
۲۷۴
(۲۵‐۲۲). Mitrovic و همـکاران به نقش برجسته 2GIRK در اثرضـد دردي مرفيـن اشـاره کرده و يافتـه اند که حـذف ژن2GIRK، سبب از بين رفتن تفاوت پاسخ دهي موش سورينر و ماده به مرفين شده، همچنيـن آستانه درد را در موش هاي سوري نر و نه مـاده کاهش مي دهد (۲۵). لذا احتمال مي رود هورمون هاي استروئيدي جنسي، بيان ژن 2GIRK را در سيستم عصبي مرکزي تحت تأثير قرارداده و تفاوت جنسي مشاهده شده، نشأت گرفته از تفاوت بيان ژن اين کانال باشد. مطالعـه حاضر با هدف تعيين نقش و تأثير هورمون هاي استروئيدي گنادال بر بيان ژن 2GIRK در نخاع موش هاي صحرايي نر و ماده انجام شده است.
مواد و روش ها
از موش هاي صحرايي نژاد Wistar نوزاد (سن ک م تر از ۱۰ روز، محدوده ی وزني ۲۵‐۲۰ گرم) و بالغ (محدوده ی وزني ۲۴۰‐۲۰۰ گرم) و از هـر دو جنـس نر و مـاده استفاده شد.
حيوانات با توجه به جنسيت و گروه آزمايشي در قفسه هاي جداگانه و در شرايط ۱۲ ساعت نور، ۱۲ ساعت تاريکي، دماي ºC۱±۲۳ و رطوبت ۵۵% نگهداري مي شدند و به جز زمان آزمايش در تمامي اوقات به آب و غذا دسترسي کافي داشتند. تمامي آزمايشات اين تحقيق، مطابق با قواعد اخلاقي انجمن بين المللي مطالعه درد و کميته اخلاق دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي انجام شد. براي انجام مطالعه، حيوانات به دو گروه کلي بالغ و نوزاد تقسيم شدند که حيوانات بالغ خود شامل چهار زير گروه دست نخورده (intact)، گنادکتومي (GDX)، Sham و گنادکتومي+ تستوسترون درماني (GDX+T) بودند.
تعداد حيوانات در هر گروه حداقل ۶ عدد بود.
جهت انجام جراحي، ابتدا حيوان با تزريق داخل صفاقي پنتوباربيتال (mg/kg ۵۰) بيهوش شد. در جنس نر با کمک قيچي پوست ناحيه اسکروتوم شکافته و به تدريج لايه هاي زير پوست برش داده شد تا اين که بيضه ها از اسکروتوم خارج شدند. سپس با استفاده از قيچي بيضه ها کاملاﹰ از بدن حيوان جدا شده و پوست اسکروتوم با نخ جراحي۰/۳ دوخته شد.
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:13 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:13 +0330 on Wednesday January 10th 2018

در گروه Shamپس از شـکافت پوست ناحيه ی اسکروتوم و مشاهده یبيضه ها، پوست اسکروتوم مجدداﹰ دوخته شد (۲۶). در جنس ماده پس از تراشيدن موي ناحيه شک م، ابتدا
اطراف آن خارج گرديد. در گروه Sham تخمدان ها، RNA در نيتروژن مايع (دماي ºC۱۸۰‐) نگهداري شدند.
شکافي به طول ۱ سانتي متر در ناحيه شکمي حيوان داده شده، پوست، بافت همبند و عضلات کاملاﹰ شکافته شد تا حفره ی شکمي نمايان شود. پس از مشاهده تخمدان ها، لوله هاي فالوپ و شيپور رح م، با کمک گره اي، جريان خون هر يک از تخمدان ها مسدود گرديد. سپس از قسمت فوقاني آن گره، لوله فالوپ را بريده و تخمدان، بافت چربي و ضماي م
همکاران /
گرديد. جهت جداسازي بافت نخـاع، پس از باز کـردن و کنـار زدن پوست ناحيه پشت حيوان، دو طـرف، بالا و انتـهاي ستون مهره ها بريده شده، سپس با تزريق نرمال سالين و فشار وارده از قسمت انتهاي ستون مهره ها، نخـاع خـارج شد. پس از جدا کردن رشته هاي عصبي، ناحيه کمري نخاع جهت انجام آزمايش بريـده شد. نمـونه هاي بافت نخـاع پس از جـداسازي به ميکروتيوب استريل منتقل و تا زمان استخراج
لوله هاي فالوپ و شيپور رح م را از شک م خارج شده و مجدداﹰ به پريتوئن برگردانده شد. در انتها بافت ماهيچه و پوست، به طور جداگانه با نخ جراحي۰/۳ دوخته شد (۲۷).
در حيوانات نر بعد از گذشت ۴ هفته از انجام گنادکتومي و رسيدن سطح هورمون هاي استروئيدي جنسي به سطوح ناچيز، تزريق داخل صفاقي تستوسترون انانتات ساخت شرکت ايران هورمون به مدت ۳ روز متوالي و به ميزان mg/kg ۱ انجام شد. گروه Sham نيز حلال تستوسترون انانتات يعـني روغن کرچک استريل دريافت کردند (۲۶).
به دليل وجود گزارشات متعدد مبني بر نقش اندک مراحل مختلف سيکل استروس در آستانه درد و اثرات ضد دردي اپيوئيدها، از انجام سيتولوژي واژن و تعيين مرحله سيکل جنسي در حيوانات ماده ی بالغ دست نخورده و Sham چشم پوشي شد (۶ و۹و۲۷).
پس از طي زمان مورد نظر جهت انجام آزمايشات، حيوانات متعاقب حدود۲۰ ثانيه مواجهـه با گاز 2CO در محفظه شيشه اي بيهوش شده، سپس سر حيوان توسط گيوتين قطع توالي و دماي annealing پرايمـرهاي اختصاصي PCR براي 2GIRK و β-actin (استاندارد داخلي) در جدول ۱
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:13 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:13 +0330 on Wednesday January 10th 2018

نشان داده شده اند. پرايمرهاي اختصاصي 2GIRK و β-actin با استفاده از نرم افزار Primer3 در سايت http://www.genome.wi.mit.edu طراحي شده و توسط نرم افزار BLAST در سايت NCBI به آدرس http://www.ncbi.nlm.nih.gov مورد تأييـد مجدد قـرار گرفتند. محصـول PCR توليد شده توسط هر يک از پرايمرهاي 2GIRK و β-actin جهت تأييد، تعيين توالي شـده (VBC biotech, Austria) و نتايج آن در GenBank ايندکس شد. کليه پرايمرها ساخت شرکت سيناژن ايران بودند.
از يک روش نيمه کمي RT-PCR، به منظور ارزيابي تغيير در ميزان بيان ژن 2GIRK استفاده شد. بدين منظور µg۱ از RNA استخراج شده به همراه مخلوط واکنشي که در ادامه مي آيد، در حجم نهايي µl۲۰ جهت واکنش RT و سنتز cDNA مورد استفاده قرار گرفت: بافر 1X واکنش RT
جدول ١ ‐ توالي ها و م شخصات پراي مرهاي استفاده شده در RT-PCR
Gene Sequence position Anneal temperature(°C) PCR product size (bp) Gene Bank accession nos.

GIRK2

β-Actin
F 5´-tgggaaactatgcctgatgt-3΄ R 5΄-ttcttccgggttcttctctt-3΄

F 5΄-gaagtaccccattgaacacg-3΄
R 5΄-gacagtgaggccaggataga-3΄ 862-881
1435-1416

282-301
1130-1111 53

55 574

849 EF156275

EF156276
٢٧٦
(50mM DTT, 20mM MgCl2, 250mM KCl, بيش تر، از يک واکنش کنترل شامل تمام اجزاي واکنش
250mM Tris HCl pH 8.3 @ 25ºC) به غير از cDNA، نيز استفاده شد. همان طور که در تصوير ۱ به ميزان μl۵ ، آنزي م M-Mulv 20iu/µl (Fermentas) ديده مي شود واکنش کنترل منجر به تکثير هيچ قطعه اي به ميزان Rnasin 40iu/ μl (Fermentas)،۱μl نشده است.
به ميزان dNTP 25mM ، ۰/۵ µl(سيناژن) به ميزان µl۵ از محصول هر PCR پس از مخلوط شدن با بافر DEPC Water ،۱/۵ µl به ميزان µl۵/۶ و µg/µl۵/۰ مخصوصloading به چاهک هاي ژل آگارز ۵/۱% Oligo dT (Fermentas)به ميزان µl۱. واکنش RT در اضافه شدند. در دو طرف نمونه ها، دو نمونه ازDNA ladder دماي ºC۴۲ به مدت ۶۰ دقيقه انجام و در انتها براي با فواصل bp ۱۰۰ اضافه گرديد. الکتروفورز به مدت ۶۰ دقيقه غير فعال کردن آنزي م M-Mulv از دماي º C۷۰ به مدت با ولتاژ ثابت ۵۰ ولت و در دماي آزمايشگاه انجام و ژل
۱۰ دقيقه استفاده شد. مورد استفاده در هنگام ساخت توسط اتيديوم برومايد از cDNA به دست آمده از هـر Rat، جـهت انجام دو رنگ آميزي گرفت. پس از پايان الکتروفورز، ژل در دستگاه
2µl Taq 5iu/µl،۱/۵ µl MgCl ۵/۰ (سيـناژن)، مقايسه بين ميانگين گروه ها در دو جنس با آزمون آناليز
سري واکنش PCR جداگانه استفاده شد. هر واکنش PCR با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي مربوط به 2GIRK يا β‐actin انجام پذيرفت. اندازه ی قطعه مورد انتظار براي هرکدام از پرايمرها در جدول ۱ آمـده است. جهت انجام PCR از cDNA به ميزانµl ۵ به همراه مخلوط واکنـشي زير در حجـم نهـايي µl۵۰ استـفاده شـد: µl dNTP 25mM۲، Gel documentation قرار گرفتـه و تحت نور UV با
زمان acquisition ۱ ثانيه، از آن عکس برداري و تصوير به دست آمده ذخيـره گرديد.
با استفـاده از نرم افزار Lab works (UVP,UK)
دانسيتـه ی باند مربـوط به 2GIRK محاسبه و براي آناليز مورد استفاده قرار گرفت.
µl 10µM، ۵ µl 10X PCR buffer۱ از هرکـدام از پرايمرهاي پيش رو و پس رو و در نهايت آب مقطر استريل تا حج م نهايي µl۵۰.
Touchgene با استفاده از دستگاه PCR واکنش و با شرايط Gradient thermocycler (Techne, UK) :زير انجام گرفت
۱. Cº۹۴ به مدت ۵ دقيقه ( ۱ سيکل) .
۲. ۳۰ سيکل شامل : Cº۹۴ ،۳۰ ثانيه، دماي annealing مناسب هر پرايمر،۳۰ ثانيه و Cº۷۲ ، ۳۰ ثانيه.
۳. Cº۷۲ به مدت ۵ دقيقه (۱ سيکل ).
1268731734566Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:13 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:13 +0330 on Wednesday January 10th 2018

شرايط واکنش PCR شامل تعداد سيکل ها و ميزان cDNA استفاده شده، به گونه اي تنظيم شد تا ميان تعدادسيکل ها و محصول PCR و نيز ميزان cDNA ورودي ومحصول PCR رابطـه اي خطـي برقرار باشـد. جهت تأييدواريانس دو طرفه انجام گرديد. همچنين از آزمون t-test براي مقايسه بين گروه ها در هر جنس استفاده شد. در اين
مطالعه ۰۵/۰ P<به عنوان حداقل سطح معني داري در نظر گرفته شده است.
يافته ها
آشکار سازي محصولات PCR، يک باند منفرد را براي هرکـدام از ژن ها نشان داد: bp۵۷۴ براي 2GIRK و bp۸۴۹ براي β-actin (تصوير۱). ه م چنين نتـايج ما نشان داد که کانال هاي پتاسيمي از نوع زير واحد 2GIRK در نخـاع موش هاي صحرايي نر و ماده بيان مي شوند.
در حيوانات نر، ميزان mRNA ژن 2GIRK در حيوانات نابالغ تفاوت چنداني با حيوانات بالغ دست نخورده (Intact) يا گنادکتومي شده نداشت.
همکاران
GDX
Intact
sham
GDX+TInfant
0
50
100
150
*
Male
Densitometric units(
×
10
3
)

GDX

Intact

sham

GDX+TInfant



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید