پژوهن ده (مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشکي شهي د بهشتي)
سال دوازده م, شماره ۲, پي در پي ۵۶ ، صفحات۱۱۵ تا ۱۲۱ تاريخ دريافت مقاله ۳/۱۲/۸۴
تاريخ پذيرش مقاله ١٥/٩/٨٥ خرداد و تير ۱۳۸۶

بررسي وضعي ت و ش دت بروز سيتوكراتين ۱۰ و ۱۹ به روش رنگ آميزي
ايمونوهيستوشيمي در ادنتوژني ك كراتوسيس ت (OKC) و مقايسه آن
با كيس ت دنتي ژروس و فولي كول دن داني
۴۳۲* ۱
دکتر مح مد م شرف، دکتر سودابه سرگلزائي ، دکتر فاط مه م شهدي عبا س ، دکتر عبدال عظي م مجتهدي

چکي ده
سابقه و ه دف: ادنتوژنيك كراتوسيت(OKC) و كيست دنتي، دو كيست تكاملي ادنتوژنيك هستند كه فك ها را درگير مي كنند. OKC پتانسيل رشدي بالائي داشته و داراي ميزان عود زيادي است درحاليکه علائم باليني كمتري از خود نشان مي دهد. هدف از اين مطالعه تشخيص OKC و كيست دنتي ژورس و افتراق آنها بر مبناي الگوي ايمونوهيستوشيمي با استفاده از سيتوكراتين هاي ١٠ و ١٩ با روش بيوتين ‐ استرپتوويدين مي باشد.
مواد و روش ها: در اين مطالعه ٦٠ نمونه بلوك پارافينه شامل ٢٠ مورد OKC ، ٢٠ مورد كيست دنتي ژروس و ٢٠ مورد
فوليكول دندان انتخاب شده و پس از برش زدن، رنگ آميزي ايمونوهيستوشيمي با استفاده از سيتوكراتين هاي ١٠ و ١٩ انجام گرديد. سپس اسلايدهاي تهيه شده فوق بصورت كيفي و كمي در زير ميكروسكوپ مورد مطالعه قرار گرفت. در اين مرحله
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:14 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:14 +0330 on Wednesday January 10th 2018

اسلايدهاي رنگ آميزي شده فوق بر اساس شدت و وضعيت رنگ آميزي در لايه هاي مختلف پوشش در OKC، كيست دنتي ژروس و فوليكول دنداني (با بزرگ نمائي ١٠) ارزيابي شد.
يافته ها: بروز سيتوكراتين هاي ١٠ و ١٩ در OKC و كيست دنتي ژروس ديده شد. سيتوكراتين ١٠ بيشتر در OKC و سيتوكراتين ١٩ بيشتر در كيست دنتي ژروس مشاهده گرديد. هر دوي اين سيتوكراتين ها معمولا در نيمه فوقاني پوشش كيست هاي فوق ديده شدند و تنها در يك مورد بروز سيتوكراتين ١٩ در فوليكول دنداني ديده شد، ولي بروز سيتوكراتين ١٠ در اين بافت ديده نشد. شدت بروز سيتوكراتين هاي فوق نيز تقريبﹰا در تمامي مواردي كه رنگ آميزي مثبت بود يكسان بود.
نتيجه گيري: سيتوكراتين ١٠ براي OKC و ١٩ براي كيست دنتي ژروس اختصاصي تر است و اين سيتوكراتين ها غالبﹰا در نيمه فوقاني پوشش كيست هاي فوق ديده مي شوند. بروز سيتو كراتين ١٠ در يك مورد فوليكول دنداني که مي تواند دال بر ترانسفورماسيون اين بافت به سمت كيستي شدن باشد.
واژگان كلي دي : ايمونوهيستوشيمي (IHC) ، سيتوكراتين ، ادنتوژنيك كراتوسيست ، كيست دنتي ژروس ، فوليكول دنداني

مق دمه

۱ ٭. نويسنده مسؤول : دانشيار، گروه پاتولوژي،دهان و فك و صورت، دانشكده دندانپزشكي، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي . آدرس برای مکاتبه: تهران، ولنجک، بلوار دانشجو، دانشکده دندانپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی شهيد بهشتی
۲ . استاديار گروه پاتولوژي، دهان و فك و صورت، دانشكده دندانپزشكي، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
۳ . استاديار گروه پاتولوژي، دهان و فك و صورت، دانشكده دندانپزشكي، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
۴ . دستيار گروه پاتولوژي، دهان و فك و صورت، دانشكده دندانپزشكي، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
ادنتوژنيک کراتوسيت (OKC) از كيست هاي مه م تكاملي ادنتوژني ك است و حدود ٣ تا ١١ درصد از اين كيست ها را تشكيل مي دهد و به علت هيستوپاتولوژي و رفتار كلينيكي منحصر به فرد، نياز به توجهي خاص دارد (١). پتانسيل رشد
OKC نسبت به ساير كيست هاي ادنتوژني ك بالاتر است و مي تواند به اندازه هاي بزرگي رسيده و منجر به تخريب قابل توجهي در استخوان شود (٢). از طرف ديگر OKC ي ك
كيست مهاج م بوده و داراي ميزان عود نسبتﹰا بالايي است که
۱۱۶
برحسب روش درماني آن، از ٣ تا ٦٠ درصد گزارش شده است (٣). تشخيص قبل از عمل جراحي نهايي OKC در تعيين و انتخاب ي ك فرمول و يا طرح درماني مناسب براي بيماران داراي اهميت مي باشد، لذا تعيين ماركرهاي ايمونوهيستوشيمي قابل قبول بر روي نمونه هاي Incisional براي تأييد تشخيص OKC قبل از جراحي نهايي كاربرد مهمي دارد (٤).
روش هيستوپاتولوژي معمولاﹰ امكان پذير است، ولي موارد و فقط در لايه هاي سطحي پوشش ديده شد (١٠).
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:14 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:14 +0330 on Wednesday January 10th 2018

تشخيص قطعي OKC بر اساس بررسي هاي ميكروسكوپي است. دو روش آزمايشگاهي قبل از تشخيص نهايي براي بررسي OKC هاي مشكو ك توصيه مي شود كه البته استفاده گسترده اي ندارند. در روش اول که الكتروفورز مايع كيستي است، ميزان پروتئين OKC خيلي كمتر از ساير كيست هاي ادنتوژني ك ف ك ها مي باشد و در روش دوم که بررسي سيتولوژي ك اسمير تهيه شده از مايع حفره كيست است، وجود سلول اپي تليايي بيشتر نشان دهنده وجود OKC مي باشد (٥). از طرف ديگر مطالعات زيادي به منظور تعيين ي ك الگوي رنگ آميزي به كم ك ماركرهاي سيتوكراتين، به منظور تشخيص دقيق كيست هاي ادنتوژنيكي انجام شده است (٦). اگر چه تشخيص OKC به Hormia و همكاران در سال ١٩٨٧ آنتي بادي هاي سيتوكراتين ١ ،٧، ٩، ١٠، ١١، ١٣، ١٦، ١٧، ١٨ و ١٩ را بر روي OKC، كيست دنتي ژورس و كيست راديكولار به روش ايمونوهيستوشيمي آزمايش كردند که سيتوكراتين هاي ٧، ١٧ و ١٩ براي تمام لايه هاي پوشش كيست هاي فوق مثبت بوده ولي تفاوت زيادي در بروز سيتوكراتين هاي فوق در اين سه كيست و در لايه هاي مختلف پوشش ديده نشد (٨). در مطالعه Morgan و همكارانش نيز بروز سيتوكراتين ١٩ در تمام لايه هاي پوشش OKC و كيست دنتي ژورس ديده شد. همچنين بروز سيتوكراتين ١٠ در لايه يک سوم سطحي كيست OKC ديده شد. در مطالعه اي ديگر توسط Mathew و همكارانش بروز سيتوكراتين ۱۹ در پوشش هاي OKC و كيست دنتي ژروس نشان داده شد. در اين مطالعه نيز بروز سيتوكراتين ۱۰ در لايه هاي سطحي و فوقاني OKC ديده شد ولي در كيست دنتي ژروس بروز آن خيلي ضعيف بود(٩). GAO و همكارانش نيز بروز سيتوكراتين ١٩ را تنها در سلول هاي لايه سوپرا بازال و تعدادي از سلول هاي لايه بازال OKC نشان دادند در حالي که در كيست دنتي ژروس، بروز سيتوكراتين ١٩ در تمامي
به كارگيري روش هاي روتين به همراه روش هاي ايمونوهيستوشيمي، براي پاتولوژيست هاي ك م تجربه، در تشخيص دقيق اين ضايعات بسيار كم ك كننده است (٧).
Meredith و همكاران در فاصله بين سالهاي ١٩٩٨‐١٩٩٠ رنگ آميزي ايمـونوهيـستوشيـمي سيتوكراتين ١٠ را بر روي نمونه هاي Fine Needle Aspiration Biopsy
(FNAB) و سپس بر روي نمونه هـاي جـراحي شده آنها، براي تفكيـ ك OKC و كيست دنتي ژروس انجـام دادند و مشخص گرديـد كه سيـتوكراتين فـوق در OKC مثبت بوده و مي تواند براي افتراق OKC از انواع غير OKC به کار گرفته شود (٤).
باتوجه به اينكه در مطالعه قبلي ماركرهاي فوق بطور همزمان برروي OKC وكيست دنتي ژروس و فوليكول
دنداني مورد بررسي قرار نگرفتند، لذا اين مطالعه با هدف ارائه يک الگوي تشخيصي بر اساس رديابي اين ماركرها بر روي اين سه بافت انجام گرديد.
مواد و روش ها
در اين مطالعه تشخيصي با مراجعه به بايگاني آزمايشگاه آسيب شناسي دانشكده دندانپزشكي دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي، كليه نمونه هاي ارسالي به اين بخش از ابتداي سال ١٣٧٨ لغايت پايان سال ١٣٨١ بررسي گرديد. نمونه هايي كه تشخيص هيستوپاتولوژي ك آنها بطور قطعي يكي از موارد كيست دنتي ژروس، ادنتوژني ك كراتوسيست و فوليكول دنداني بود استخراج شده و از هر ضايعه ٢٠ نمونه و مجموعﹰا ٦٠ نمونه جهت بررسي تفكي ك و كليه اطلاعات باليني در فرم هاي اطلاعاتي ثبت گرديد.
در Oven گذاشته شد. در مرحله بعد پارافين زدايي و سپس در محلولهاي اتانول٧٠ ، ٨٠، ٩٠ ، ٩٥ و١٠٠ (در هر

بر روي بلوكهاي پارافينه نمونه هاي فوق، مراحل آزمايشگاهي رنگ آميزي ايمونوهيستوشيمي انجام گرديد که ابتدا برش هاي ٥ ميكروني بر روي لام هاي اختصاصي Silon coated تهيه و به مدت ي ك شب (Overnight) مدت ي ك ساعت در دماي اتاق آغاز شد که در اين مرحله اطراف لام ها خش ك و آنتي بادي ثانويه و پس از آن محلول DAB به سيتوكراتين هاي مذبور (mono clonal anti – Mouse) اضافه شد و لام هر ٥ دقيقه در زير ميكروسكوپ كنترل گرديد. هر موقع كه رنگ قهوه اي سلول ها به حد مناسبي رسيد لام ها در آب مقطر قرار داده و سپس شسته شده (٥ دقيقه) و رنگ آميزي هماتوكسيلين و دهيدراتاسيون به ترتيب زير صورت گرفت:
ابتدا لام ها بمدت ٥ دقيقه با هماتوكسيلين رنگ شده و
آب گيري نمونه ها در زايلن (Xylene) و الكل ( سه ظرف زايلن هر كدام ٨ دقيقه و اتانول ١٠٠ ، ٩٩ هر كدام به مدت ٥ دقيقه) انجام شد. سپس لام هاي فوق به مدت٣٠ دقيقه در محلول هيدروژن پراكسيد (٣/٠% PH= و غلظت ١% در متانول) جهت غير فعال كردن آنزي م پراكسيداز داخلي گذاشته شده و ادامه دهيدراتاسيون با محلولهاي اتانول ٩٥، ٩٠ و ٨٥ به مدت ٥ دقيقه صورت گرفت. در مرحله بعد نمونه جهت شستشو به مدت ١٠ دقيقه در آب روان گذاشته شد. در ادامه كار نمونه ها در محلول سيترات بافر PH=6 و بعد در مايكروفر به مدت ٥ دقيقه براي ٢ يا ٣ بار (با توجه به اندازه نمونه) و سپس٣٠ دقيقه تا ي ك ساعت در حرارت اتاق (Room temperature) جهت خن ك شدن گذاشته شد. در مرحله بعد شستشو مجدد در آب روان و سپس با محلول PBS به مدت ٥ دقيقه انجام گرديد. پس از خش ك كردن اطراف نمونه بر روي لام، Non–serum protein در محل بافت اضافه شده، به مدت ني م ساعت در ي ك ظرف در بسته با كمي رطوبت قرار داده شد و سپس لام هاي مورد نظر در PBS شسته شده و بعد آنتي بادي اوليه (Anti human cytokeratin) به اندازه ٢٠ ميكروليتر بر روي محل بافت در روي لام ريخته شد.
مرحله دوم با قرار دادن لام ها در ظرف در بسته حداقل به كدام به مدت ٥ دقيقه) قرار داده شدند و بعد به مدت ٥ دقيقه با آب مقطر شستشو داده شده و سپس لامل با چسب بر روي اسلايد فيكس و در زير ميكروسكوپ مطالعه شدند.
در اين مطالعه شدت رنگ آميزي بشرح زير محاسبه شد:
(‐) در موردي كه رنگ آميزي منفي بود.
(+)در مواردي كه شواهدي دال بر رنگ شدن ديده شد (خفيف)
(++)رنگ آميزي ديده شد. ( متوسط)
(+++)رنگ آميزي شديد و قوي در روي لام ديده شد(شديد) (١١)
1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:14 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:14 +0330 on Wednesday January 10th 2018

در ادامه، درصد سلول ها در لايه هايي كه رنگ گرفته بودند تعيين شد.
يافته ها
از مجموعه ۶۰ نمونه مورد استفاده در اين تحقيق عبـارتاز ۲۰ مورد OKC ، ۲۰ مورد كيست دنتي ژروس و۲۰ مـوردفوليكول دنداني بود که از ۲۰ بيمار مبتلا به OKC، ۵/۳۵% زير ۲۰ سال، ۲/۴۱% بين۲۰ تا ۴۰ سـال و ۵/۲۳% بـالاي ۴۰ سال سن داشتند. در مورد كيست دنتي ژروس۶۰% زيـر ۲۰ ســال، ۲۵% بــين۲۰ تــا ۴۰ ســال و۱۰% بــالاي۴۰ ســال سن داشتند. بيـن گروه هاي سني و نتيجه رنگ آميزي براي
۱۱۸
ســيتوکراتين ۱۹ ارتبــاط معنــي دار آمــاري مــشاهده نــشد
(جدول ۱).

1268731734566

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:14 +0330 on Wednesday January 10th 2018

Downloaded from pajoohande.sbmu.ac.ir at 10:14 +0330 on Wednesday January 10th 2018

جدول ۱ ‐ توزي ع مبتلايان به ادنتوژني ك كراتوسي س ت . كي س ت دنتي ژرو س وفوليكول دنداني بر اسا س گروه هاي سني و نتيجه
رنگ آميزي سيتو كراتين ۱۹

ن
ر

تيجه
نگ

آميزي

ين
يتوكرات
س

۱۹

ني
س

گروه

مثبت

منفي

زير
۲۰
سال

(N=19)

۱۱

)
۹
/
۵۷
%
(

۸

)
۱
/
۴۲
(
%

۲۰

تا

۴۰
سال

(N=12)

۵

)
۷
/
۴۱
%
(

۷

)
۳
/
۵۸
%
(

بالاي
۴۰
سال

(N=16)

۴

)
۷
/
۶۶
%
(

۱۲

)
۳
/
۳۳
%
(

وع
م
ج
م

(N=47)

۲۰

)
۵
/
۴۲
%.
(

۲۷

)
۵
/
۵۷
(
%

ن

ر



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید