پژوهنده (مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي)
تاريخ دريافت مقاله: 24/3/1391 سال هفدهم، شماره مرداد 3و، پي در شهريور پي 139187 ، صفحات 104 تا 113 تاريخ پذيرش مقاله: 2/8/1391
بررسي بيان ماركرهاي گليالي در سلول هاي شبه اليگودندروسيتي مشتق از مغز استخوان القا شده توسط هورمون تيروئيدي
دكتر حجت اله عباس زاده1، دكترتقي طريحي2*، دكتر مجيد صادقيزاده3، دكتر عليرضا عزيززاده دلشاد4

دانشجوي دكتري تخصصي، گروه علوم تشريح، دانشكده علوم پزشكي، دانشگاه تربيت مدرس
استاد، گروه علوم تشريح، دانشكده علوم پزشكي، دانشگاه تربيت مدرس
استاد، گروه ژنتيك، دانشكده علوم پايه، دانشگاه تربيت مدرس
-10921187591

استاديار، گروه علوم تشريح، دانشكده پزشكي، دانشگاه شاهد چكيده
سابقه و هدف: درمان صدمات ناشي از آسيبهاي مخرب وارد به سيستم عصبي، به علت ناتواني در بازسازي سـلول هـاي از بـين رفتـه،جايگزين كردن ميلين صدمه ديده، و برقراري مجدد ارتباطهاي نوروني، به تأخير افتاده و يا انجام نمي شـود . در ضـايعه نخـاعي و ديگـربيماريهاي تروماتيك، دميلينه شدن آكسون سالم يكي از عوامل مؤثر در از دست دادن عملكرد سلول اسـت . مطالعـات قبلـي پيشـنهادمي كند بهبود اساسي سلول ممكن است از طريق ميلين سازي مجدد صورت پذيرد. اين مطالعه به بررسي اثـرTriiodothyronine (T3) بر تمايز سلول هاي بنيادي مشتق از مغز استخوان (BMSCs) به سلول هاي شبه اليگودندروسيت مي پردازد.
مواد و روشها: اين تحقيق با روش تجربي انجام شد. تحت شـرايط اسـتريل، BMSCs از اسـتخوان ران موشـهاي صـحرايي مـاده بـالغاستخراج شد و براي بيان ماركرهاي فيبرونكتين، CD45, CD90, CD44 و Oct-4 بررسي گرديد. ابتدا BMSCs در مرحله پيش القـا بـااستفاده ازDMSO+RA به سلول هـاي نوروپروژنيتـور (NPc) تمـايز داده شـد. سـپس در مرحلـه القـا بـا اسـتفاده از القـا كننـده هـايHRG(heregulin)،PDGF،bFGF و T3 به سلول هاي شبه اليگودندروسيت (OLCs) تمايز داده شد. در مراحل پـ يش القـا و القـا، بيـ ان پروتئيني با استفاده از ماركرهاي فيبرونكتين، O1 ,O4 ،GFAP ،NF160 ،NF68 ،nestin و Oligo2 با روش ايمونوسيتوشـ يمي بررسـيشد و همچنين بيان ژن هاي NeuroD و Oct-4 با استفاده از RT-PCR بررسي گرديد.
يافته ها: مطالعات ايمونوسيتوشيمي نشان داد كه بيان ماركرهاي فيبرونكتين، CD90 ،CD44 در سلول هاي استرومايي مغـز اسـتخوانبه ترتيب برابر با 45/0%±32/94 و 24/0%±48/95 و 82/0%±16/97 (05/0 p<) مي باشد. بررسي ماركرهـاي Oligo2, O4 ,O1 نشـانداد كه در مرحله القا تركيب bFGF ،PDGF ،HRG و ng/ml) T3 25) مي تواند نقش مؤثري در تمايز سـلول هـايBMSCs بـهOLCs داشته باشد.
نتيجه گيري: DMSO و RA موجب تمايز سلول هاي BMSCs بـه سـلول هـاي نوروپروژنيتـور، و تركيـب bFGF ،PDGF ،HRG و T3 ng/ml) 25) موجب تمايز سلول هاي نورواپيتليال به سلول هاي شبه اليگودندروسيت مي شود.

-18286236704

واژگان كليدي: سلول هاي بنيادي، تمايز، نوروگليا لطفاً به اين مقاله به صورت زير استناد نماييد:
510311048

Abbaszadeh H, Tirahi T, Sadeghizade M, Delshad AR. Expression of glial markers in bone marrow-derived oligodendrocyte-like cells induced by thyroid hormone. Pejouhandeh 2012;17(3):104-13.

مقدمه0F1
بيماريهاي متعددي شناسايي شده اند كه در سيستم اعصـابمحيطي و مركزي منجر به از بين رفتن ميلين مـي شـوند (1).

*نويسنده مسؤول مكاتبات: دكترتقي طريحي؛ تهران، بزرگراه جلال آل احمد ،دانش گاه تربي ت م درس، دانش كده عل وم پزش كي، گ روه عل وم تش ريح. تلف ن:
88790109-21-98+، نمـــابر: 88678104-21-98+؛ پســـت الكترونيـــك:
[email protected]

بهب ودي در ض ايعات CNS ب ه عل ت ع دم توان ايي كام ل در بازسازي سلول هـاي از دسـت رفتـه، جـايگزين كـردن ميلـينآس يب دي ده، و برق راري مج دد ارتباط ات عص بي ، يك ي از معض لات ج دي بيم اران م يباش د (2). آس يب ميل ين در آكسون هاي سالم، يك فاكتور مهم در فقـدان عملكـرد عصـباست. مطالعاتin vivo و in vitro نشان مي دهـد كـه در بـيناي ن اج زا، وج ود س لول ه اي اليگودندروس يت ب راي ت رميم آكسون هايي كـه ميلـين را از دسـت داده انـد و فاقـد عملكـردشده اند ضروري اسـت (3). اليگودندروسـيت هـا را مـي تـوان ازمنابع مختلفي همچون سلول هاي بنيادي جنيني و سلول هـايپياز بويايي و سلول هاي بنيادي بالغ استحصال كرد كه يكـي از منابع سلول هاي بنيادي بالغ، مغز استخوان مي باشد.
مغز استخوان، ارگاني است كه حاوي دو نوع سلول بنيادي بالغ است كه شامل سلول هاي بنيادي خونساز يا HSCsو سلول هـاياسترومايي مغز استخوان BMSCs مي باشد. اين سلول هـا عـلاوهبر تبديل به سلول هايي با منشأ مزودرمي به سلول هايي بـا منشـ أ غير مزودرمي مثل سلول هاي عصبي و گليالي نيز قابـل تبديلنـد (4). بنابراين استفاده از آنهـا جهـت درمـان بيماريهـا و ضـايعاتمختلف سيستم عصبي از جمله تخريب ميلين و بازسازي مجدد آن مورد توجه قرار گرفته است (5).
برخــي محققـ ين بيـ ان ماركرهــاي عصـ بي را بوسـ يله βME (β-mercaptoethanol) نشــــ ان داده انــــ د( 6). در مطالعه اي ديگر، القاي BMSCs انساني با βME براي يك روز و سپس RA به مدت سه روز، منجر به ايجاد سلول هاي شبه گليال ميليني گرديد كه سطح بسـ يار پـا ييني از O4 را بيـ ان كردند. در ادامه پـس از القـاي ايـ ن سـلول هـا بـا PDGF ،F، bFGF و HRG به مدت سه روز و سپس پيوند آنها در مـو ش ص حرايي، ميل ين س ازي در ش بكيه چش م انج ام ش د (7).
جايگزيني نواحي دميلينه شده با سلول هـاي ميلينـه كننـدهپيوندي عقيده اي است كه از مدتها پيش مـورد بررسـي قـرارگرفته است. جهت دستيابي به اين هدف در مدل هـاي دارايضايعه نخاعي، پيوند سلول هاي مختلف مانند اليگودندروسيت (8)، شــوان ســل (9)، ســلول هــاي غــلاف بويــا يي (10)، و سلول هاي بنيادي عصبي بزرگسالان مورد بررسي قرار گرفت (11 و 12). مطالعــات متعــدد ي بــر روي چگــونگي تمــايزBMSCs به سلول هاي عصبي-گليالي بـر اسـاس فاكتورهـايمختلفي چون انواع القاكننده ها، فاكتورهاي رشد، محيطهـايكش ت متف اوت و ه م كش تي، و تب ديل اي ن س لول ه ا ب ه سلول هايي شبيه به رده هـاي مختلفـي از سـلولهاي عصـبي -گليالي انجـام شـده اسـت . بـا توجـه بـه بهينـه نبـودن ايـنتحقيقات، در اين تحقيق سعي بر آن بود كه تمايز سلول هاي استرومايي مغز استخوان به سلول هاي شبه اليگودندروسـيتدر محيط كشـت در گـروه علـوم تشـريح دانشـكده پزشـكي دانشگاه تربيت مدرس در سال 91 مورد بررسي قرار گرفته و بهينه شود و بيان ماركرهاي گليالي ارزيابي شود.

مواد و روشها
اين تحقيق با طراحي تجربي انجام گرفت. در اين پـژوهش ازموش صحرايي ماده و بالغ نژاد اسـپراگو -داولـي تهيـه شـده ازمؤسسه پاستور با سن 8-6 هفته استفاده شد. حيوانات در يك دوره روش نايي و ت اريكي 12 س اعته و در ش رايط مطل وب و اس تاندارد حيوانخان ه گ روه عل وم تش ريح دانش كده پزش كي دانشگاه تربيت مدرس نگهداري شدند.
براي گرفتن مغز استخوان از يك سرنگ ml 5 (بـا سرسـوزنمشكي) حاوي ml 1 محيط كشت DMEM-F12 (UK, Gibco)، استفاده شد. محتوي داخـل سـرنگ در زيـر هـود در فلاسـكحاوي محيط DMEM-F12 (UK, Gibco) و FBS 15% (UK, Gibco) ريخته شد. پس از گذشت 24 ساعت از زمـان تخليـهمغز استخوان در فلاسك، محيط كشت سلولي بـا محـيط تـازهتعويض شد. سلول هاي استرومايي چسـبيده بـه كـف فلاسـكباقي مانده و سلول هاي خوني شناور حذف شدند. هنگامي كـهتراكم سلول هاي چسبيده به كف فلاسك به 70 تا 80% رسيد ،پاسـاژ داده شـدند. پاسـاژ سـلول هـا توسـطTrypsin 0.25% (Germany, Merck) و EDTA 0.04% (Germany, Merck) انجام شد و اين عمل تا پاساژ چهار ادامه يافت، در اين شـرايطسلول ها از يك مورفولوژي يكسان برخوردار شدند (5). بررسي زنده بودن بر روي سلول ها انجام شـد و سـپس بـراي بررسـيخلوص آنها و همچنـين اسـترومايي بـودن آنهـا از آنتـي بـاديفيبرونكتين و CD45, CD90, CD44و همچنين بيان mRNA ژن Oct-4 استفاده شد. ضمناً جهت بررسي احتمالي تمايز اين سلول ها به سلول هاي شبه عصبي و گليالي، بيان آنتي بادي هاي O1 ،GFAP ،NF68 ،Nestin، و O4 مورد ارزيابي قـرار گرفـت.
به منظور بررسي ميزان زنده بودن سلول ها تسـت تريپـان بلـوانجام شد؛ در اين آزمون در حجمي مشخص از سوسپانسـيون،سلول ها به نسبت مساوي با تريپان بلو رنگ شدند. سلول هـايمرده به رنگ آبي مشخص شده و سلول هاي زنده شفاف نشـانداده شدند. تعداد سلول هـا ي زنـده و مـرده توسـط لام نيوبـاربه وسيله ميكروسكوپ اينـورت بـا بزرگنمـايي 200 شـمارشگردي د (6). پ س از تريپس ينه ك ردن BMSCs پاس اژ چه ار ،5000 سلول به طور مساوي در هر يك از خانه هاي پليـت 12 خانه اي لامل گذاري شده ريخته شد. سـپس طـي دو مرحلـه، پيش القا و سپس القا انجام شد.

مرحله پيش القا
در مرحله مقدماتي يا پيش القـا ، از اثـر القـايي DMSO 2%، βME بر روي BMSCs استفاده گرديد (7). بـد ين ترتيـ ب كـهابتدا پليت هاي 12 خانه لامل گذاري و سپس با ژلاتـين 1/0% آغشته شد و پليت به مدت يك شب در انكوباتور قـرار گرفـت.
پس از تريپسينه كردن سلول هاي پاسـاژ چهـار، تعـداد 5000 سلول به طور مساوي در هر يك از خانه ها ريخته شـد. پـس ازگذشت 24 ساعت از مرحله پيش القـا ، شستشـو توسـطPBS انجام شد و با اضافه نمـودن محـيط وFBS 15% مرحلـه القـاتوسط (RA (1 µM) (Keilhoff 2006 به مدت 3 روز اجرا شد .سپس لامل ها برداشت شـد و پـس از شستشـو بـاPBS بـرايانج ام ايمنوسيتوش يمي آم اده گردي د. جه ت بررس ي بي ان ژن هاي NeuroDو Oct-4از تكنيك RT-PCR استفاده شد.

مرحله القا
پــس از شستشــوي ســلول هــا بــاPBS ، محــيط كشــت F12-DMEM ح اوي FBS 15% و مجموع ه اي از ng/ml 10
فـاكتور رشـد فيبروبلاسـتي ng/ml ،(bFGF) (UK, Gibco) 5 فاكتور رشـد مشـتق از پلاكـت (PDGF-AA) (USA, ICN) و ng/ml 200 بتـا هرگولين انسـاني (Heregulin: HRG) (USA, Chemicon) براي دو روز جايگزين محـيط كشـت قبلـي شـد
(8). در پايان اين مرحله، يك ارزيابي از آنتي بـادي هـاي اوليـه شــامل Oligo2 ،O1 ،GFAP ،NF68 ،Nestin و O4 بــه روش ايمونوسيتوشيمي بر روي سلول ها انجام شد. در مرحله دوم القا پس از خارج كردن محيط كشت فوق و شستشوي سلول ها بـا
PBS، محـ يط كشـ ت DMEM -F12 حـ اوي FBS 15% و مقــادير متفــاوت ي از هورمــون 3T بــراي ايجــاد ســلول هــاي شبه اليگودندروسيت براي مدت دو روز اسـتفاده شـد. لازم بـهذكر است در خصوص ميزان دوز 3T با توجه به منـابع، مقـاديرng/ml 10، 50 و 90 براي تعيين دوز بهينه بررسـي مـي شـود (9). در بررسي ايمونوسيتوشيمي مراحل كار مشابه قبل انجـامشـد. ب ه اي ن ترتي ب ب الاترين درص د تم ايز ب ه س لول ه اي شبه اليگودندروسيت توسط دو گروه پيش القا و القـا مشـخصشد.

ايمنوسيتوشيمي
BMSCs القا نشده و القا شده ابتدا جهـت ثبـوت در معـرضپارافرمالدهي د 4% ب ه م دت 30 دقيق ه ق رار گرفت ه، س پس شستشوي سلول ها با PBS سه بار و هر بار 5 دقيقه انجام شـد.
نمونه ها به مدت يك ساعت در معرض مخلوط سرم بـز 10% و Triton X-100 قرار داده شدند. پـس از رق يـ ق نمـود ن 1:150 آنتي بادي هاي اوليه فيبرونكتين، O1 ،GFAP ،NF68 ،Nestin، Oligo2 و O4 كه همه از نوع موشـ ي بودنـد، هـر كـدام بطـورمجزا بر روي يك Cover slip ريخته شد. به منظور جلـوگيرياز خشك شدن آنتي بادي، نمونه با يك قطعه پارافيلم پوشـ يده شد و در داخل پتري ديش مرطوب قرار گرفت و به مدت يـكشب در درجه حرارت 37 انكوبه شد. لام ها پس از شستشـو بـاPBS مانند قبل به مدت دو ساعت در دماي محيط در معـرضآنتي بادي ثانويه ضد موشي( 1:200) كونژوگـه بـهFITC قـرارگرفتند و سپس شستشو با PBS انجام شد. در ادامه ،نمونـه هـاتوسط ميكروسـكوپ فلورسـانس مـورد بررسـي قـرار گرفت نـد . جهت شمارش سلول ها از اتيديوم برومايد 01/0% به مدت يك دقيقه استفاده شد و شستشو توسط PBS انجام گرديـد (10). در پايان، هر لامل بطور معكوس توسط بافر گليسرول بـر رو ي لام قرار گرفت. نحوه شمارش بدين ترتيب بود كـه از هـر 200 سلول شـمارش شـده در منـاطق مختلـف لامـل، سـلول هـا ي ايمونوپوزيتيو مشخص هر گروه ثبت مي شد. اين كار روي پـنجلامل در يك وهله آزمايش انجام شد و در مجموع آزمايش پنج بار تكرار شد.

RT-PCR
سلول هاي متمايز شده گروههاي مختلـف و نيـز سـلول هـايمتمايز نشده به صورت جداگانه از كف فلاسك هـاي كشـت بـامحلول تريپسين و EDTA كنـده شـدند. پـس از سـانتريفيوژشدن، مايع رويي سلول ها دور ريخته شد و توده سلولي بدست آمـده بـراي اسـتخراجRNA آمـاده شـد. پـس از ليـز نم ودنسـلول هـا بـه كمـك محلـولRNX Plus. Cinna Gen Inc ، استخراج RNA سلولي انجـام شـد. سـپس واكـنش رونويسـيمعكوس انجام شد، كه طي آن آنزيم DNA پلي مراز وابسته بـهRNA با كمك پرايمرهايي كه به mRNA هيبريـد مـي شـوند،mRNA را به cDNA تبديل مي كند. در مطالعه حاضر، جهـتسـاختcDNA از كيـتRevert aid H Minus-First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, K1632) استفاده شد. پس از پايــان ســاختcDNA در حجــم بــالا ، PCR در حجــم 25 ميكروليت ر بــا اســتفاده از كيــت 2XPCR Master Mix- Fermentas انجام گرفت كه شامل مواد زير مي باشد:
،reaction buffer ،0/05 u/μl Taq DNA polymerase dATP, :شــامل) dNTP از هــر 0/4 mM و ،4 mM MgCl2
dCTP, dGTP and dTTP
سپس مواد لازم طبق دستور كيـ ت بـرا ي حجـم نهـايي 25 ميكروليتر اضافه شد كه شامل مواد زير مي باشد:
5/12 ميكروليتر 2XPCR Master Mix، پرايمرهاي فـورواردو ريورس با غلظت 100 ميكرومـولار هركـدام 5/0 ميكروليتـر ، cDNA به ميزان يك ميكروليتر، و آب فاقد نوكلئاز بـه ميـزان5/10 ميكروليتر.
لازم به توضيح است كه در هر بـار انجـامPCR يـك كنتـرلمنفي نيز به كار گرفتـه شـد. تيـوب كنتـرل منفـي بـه جـايcDNA حاوي 5 ميكروليتر آب ديونيزه استريل و پرايمرها بود .
پس از پايان واكنش PCR، 10 ميكروليتر از محصـول واكـنشبر روي ژل آگارز 2% الكتروفورز شد.

تجزيه و تحليل داده ها
تمام مقادير برحسب (mean ± SEM)ارائه شد و مقايسه بين گروههـا ب ا روش آن اليز واري انس يكطرف ه(ANOVA) انج ام گرديد.

0
20
40
60
80
100
120
های

سلول

درصد

زنده

BMSC DMSO BME

0

20

40

60

80

100

120



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید