پژوهنده (مجله پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي) تاريخ دريافت مقاله: 14/7/88 سال پانزدهم، شماره 1، پي در پي 73، صفحات 12 تا 18 تاريخ پذيرش مقاله: 29/10/88 فروردين و ارديبهشت 1389

بررسي جهش هاي اگزوني ژن NOD2 در بيماران ايراني مبتلا به كرون
دكتر نصرت اله نادري1، دكتر آلما فرنود2*، منيژه حبيبي2، هديه بالايي2، دكتر همايون زجاجي1، محسن چياني2، علي تهامي2، دكتر فرزاد فيروزي2، معصومه سلطاني2، دكتر رحيم آقازاده3 ، دكتر فرامرز درخشان1، دكتر محمد رضا زالي3

استاديار، مركز تحقيقات بيماريهاي گوارش و كبد، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
محقق، مركز تحقيقات بيماريهاي گوارش و كبد، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي
-9898211711

استاد، مركز تحقيقات بيماريهاي گوارش و كبد، دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي چكيده
سابقه و هدف: ژن NOD2 به عنوان ژني كه ارتباطي قوي با بيماري كرون دارد، شناخته شده اسـت. ولـي جهـشهـاي ايـن ژن درجمعيتهاي مختلف، فراوانيهاي متفاوتي را نشان دادهاند. هدف از مطالعه حاضر، تعيين توالي تمام اگزونهـاي ژنNOD2 در بيمـارانايراني مبتلا به كرون بود تا جهش هاي موجود در اين ژن را بيابيم و فراواني هريك از آنها را در بيماري كرون در مقايسه با افراد شـاهدبررسي نماييم.
مواد و روش ها: در مطالعه تحليلي مورد-شاهدي 90 بيمار كرون و 120 فرد سالم كه از نظر سن و جنس با بيمـاران همسـان بودنـد،مورد بررسي قرار گرفتند. اين افراد در طي سه سال (1388-1386) به بيمارستان طالقاني وابسـته بـه دانشـگاه علـوم پزشـكي شـهيدبهشـتي مراجعـه كـرده بودنـ د. تمـام منـاطق اگزونـي ژن NOD2 در ايـن افـراد بـه روش (polymerase chain reaction) PCR و sequencing مورد بررسي قرار گرفت و در دو گروه بيمار و شاهد مقايسه شد.
يافته ها: 21 جهش در تمام اگزون هاي ژن NOD2 يافت گرديد كه 8 عدد از اين جهش ها فراواني آللـي بـيش از 5% داشـتند. هشـتموتاسيون جديد (يكي در اگزون 2 و 7 عدد در اگزون 4) يافت شد. سه جهش شـايع ژنR702W ،G908R) NOD2 و 1007fs) بـهترتيب فراواني آللي برابر با 3/2%، 3/13% و 7/1% داشتند. سه جهش جديـدA794P ،P371T و Q908H و نيـز جهـشR702W در بيماران كرون به شكل معنيداري فراوان تر از گروه شاهد بود (001/0<p).
نتيجه گيري: 8 جهش جديد در ژن NOD2 يافت شد ولي هنوز اهميت پاتوفيزيولوژيك اين جهش ها نامشخص است. بر اسـاس ايـنمطالعه به نظر مي رسد بيماران ايراني با گنجينه ژنتيكي متفاوت ممكن است خصوصيات جديدي را براي حساسيت به بيمـاري داشـتهباشند.
واژگان كليدي: بيماري كرون، ژنNOD2، جهش.
15245239

مقدمه1
بيماري كرون (Crohn’s Disease يا CD) زير مجموعـه اي از بيماريهاي التهـابي روده (Inflammatory Bowel Disease يا IBD) است كه بـا التهـاب تمـام لايـه هـاي جـدار دسـتگاهگوارش مشخص مي شود. اين بيماري مي تواند هر منطقـه اي از دستگاه هاضمه از دهان تا معقد را گرفتار كند (1). در بيشـترموارد بيماري كرون بر اساس علائم باليني، اندوسـكوپي و نيـزيافته هاي بافت شناسي تشخيص داده مـي شـود . بـا ايـن حـال

*نويسنده مسئول مكاتبات: دكتر آلما فرنـود ؛ تهـران، بزرگـراه چمـران، خيابـانيمن، بيمارستان طالقاني، مركز تحقيقات بيماريهاي گوارش و كبد؛ پست الكترونيك: [email protected]
تفاوت در وسعت بيماري، علائم خارج روده اي، سير بيمـاري وپاسخ به درمان، زير گروههـاي متعـددي را بـراي بيمـاران بـهوجود مي آورد. اين تنوعهاي فنـوتيپي، عوامـل مختلفـي را بـهعنوان علت بيماري كرون مطرح مينمايد.
با وجود انجام مطالعات گسترده باليني و ژنتيكي، هنوز علـت وپاتوژنز دقيق بيماريهاي التهابي روده و بيماري كرون مشـخصنشده است. بيماري كرون از بيماريهاي چند عاملي است كه به طــور عمــده ســه عامــل ايمونولوژيــك، عوامــل محيطــي وخصوصــيات ژنتيكــي فــرد در پــاتوژنز آن نقــش دارنــد (2).
مطالعات اپيدميولوژيك عوامل مختلف محيطي از جملـه علـلعفوني و مصرف سيگار را به عنوان عامل خطر بيمـاري كـرونمطرح نموده اند. از طرفي عوامل ژنتيكي نيز با بيمـاري كـرونارتباطي قوي دارند و در مطالعـات اوليـه بـر روي دو قلوهـايتـك تخمـي و نيـز بررسـيهاي بع دي در مطالعـات ف اميلي وlinkage analysis ايــن ارتبــاط مطــرح شــده اســت (3). تحقيقات متعددي در جهت روشنتـر شـدن ارتبـاط ژنتيكـي مناطق مختلف ژنوم بـا بيمـاري كـرون انجـام گرفتـه اسـت ومنـاطق بسـياري از كرومـ وزومهـا را بـا ايـن بيمـاري مـرتبط دانسته اند. هريك از اين مناطق يا لوكوسهاي ژنتيكي، ژن هاي متعددي را در برميگيرند (7-4،2).
يكي از لوكوسهاي مرتبط با بيماري كرون، ناحيـه اي بـر رويكروموزوم 16 به نام IBD1 است كه شامل ژن NOD2 اسـت . ژن NOD2 يا CARD15 كه در سال 2001 به طور جداگانه توســط Hugot و همكــاران (8) وOugra و همكــاران (9) معرفي شد، اولين ژن شناخته شده مرتبط با بيماريهاي التهابي روده به خصوص بيمـاري كـرون اسـت. ژن NOD2 پـروتئينNOD2 را كــــد مــــيكنــــد كــــه داراي دو قســــمت (caspase recruitment domain) CARD، ي ك بخ ش (nuclear binding domain) NBD و يـك بخـش غنـي ازلوسـين بـه نـام (leucin-rich repeats) LRR اسـت (10). بخ ش LRR در تشـخيص ليپـوپلي سـاكاريدهاي باكتري ايي (LPS) نقش دارد، در حالي كه قسـمتهايCARD پـروتئين
NOD2 را قادر به فعال ساختن آبشـار(nuclear factor B) NF-kB و ايجاد آپوپتوز مي نمايد (8).
با توجه به اينكه تاكنون مطالعات محدودي در زمينـه ژنتيـكبيماري كرون در جمعيت ايراني صورت گرفته است و در تنهـامطالعه انجام شده بر روي سـه جهشـ هاي شـايع ژنNOD2 ، فقط يكي از آنها (R702W) با بيماري كرون در ايران مـرتبطشناخته شده است (10)، در مطالعه حاضر تصميم گـرفتيم تـاتمام اگزونهاي ژن NOD2 را براي يافتن جهشـهاي ايـن ژنبررسي كنيم و فراواني هريك از آنهـا را در بيمـاري كـرون درمقايسه با افراد شاهد بررسي نماييم.

مواد و روش ها
در اي ن مطالع ه تحليل ي م ورد-ش اهدي، 90 بيم ار ك رون اسپوراديك و 120 فرد شاهد سالم كه از نظر سن و جـنس بـابيماران همسان بودند، وارد مطالعه گرديدند. اين افراد در مدت سه سال (1388-1386) بـه بيمارسـتان طالقـاني وابسـته بـهدانشگاه علوم پزشـكي شـهيد بهشـتي مراجعـه نمـوده بودنـد.
بيمــاري كــرون براســاس يافتــههــاي بــاليني، آندوســكوپي،راديولوژيـك و هيسـتوپاتولوژيك (13-11) توس ط متخص ص گوارش تشخيص داده شد و پرسشنامه كاملي براي هـر بيمـارتكميـل گرديـد. فنوتيـپ كـرون براسـاس طبقـ هبنـدي ويـن (Vienna Classification) (14) شــامل منطقــه بيمــاري،رفتار بيماري و سن در زمان تشخيص، گروه بنـدي شـد. گـروهشاهد از افراد سالم بدون علائم گوارشي يا سـابقه شخصـي يـاخانوادگي هر بيماري مهمي انتخـاب شـدند. پروتكـل مطالعـهتوسط گروه اخلاق مركز تحقيقات گـوارش مـورد تأييـد قـرارگرفته و از تمام افراد شركت كننده در مطالعه فرم رضايت نامـهكتبي اخذ گرديد.
DNA ژنومي از لكوسيت هاي خون محيطي به روش استاندارد
“فنل كلروفـورم ” (15) اسـتخراج شـد. تمـام اگـزون هـاي ژنNOD2 براساس بانك اطلاعـاتي Genbank و بـا پرايمرهـاياختصاصي (جدول 1) تكثير شـدند . بـراي هـر اگـزون از يـكجفت پرايمر استفاده گرديد، بـه جـز اگـزون 4 كـه بـه دليـلبزرگي قطعه از 5 جفت پرايمر استفاده شد. واكـنشPCR در حجـم µl25 شـامل Tris-HCL ،10mM بـا PH برابـر 8/8، mM5/1 از محلــول 2mM ، MgCl50 از محلـ ـول KCL، mM250 از mM ،dNTPs5/0 از هــر يــك از پرايمرهــا ، 2 واحد آنزيم DNA پلـي مـراز (فرمنتـاز، آلمـان) و ng 200 از DNA ژنومي انجام گرفت. شرايط PCR بـراي تمـام قطعـاتشامل: دناتوراسـيون ابتـدايي درC °94 بـه مـدت 10 دقيقـه،سپس 35 سيكل شامل C°94 براي 30 ثانيه، C°56 براي 30 ثانيه و C°72 به مدت 30 ثانيه و طويل شدن نهايي در C°72 به مدت 10 دقيقـه بـود . سـنتز مناسـب محصـولاتPCR بـااستفاده از الكتروفورز بر ر وي ژل آگارز (5/1%) بررسي گرديد و سپس قطعـات تكثيـر شـده، سـكانس گرديدنـد (بـا دسـتگاه
ســاخت شــركت ABI 3130XL Genetic Analyzer
Applied Biosystems، آمريكا) (شكل 1). نتايج حاصـله بـااستفاده از نرمافزار Version 6) Lasergene، محصول شركت DNASTAR، آمريكـا) بـا سـكانس ثبـت شـده ژن NOD2
مقايســه (Accession No: AF178930) Genbank در .گرديد
بررسيهاي آماري با استفاده از آزمون مربع كاي يا دقيق فيشـرانجام گرفت و p كوچكتر از 05/0 معني دار در نظر گرفته شد. اطلاعات با استفاده از نرمافزار Version 13) SPSS) تجزيه و تحليل گرديد.

يافته ها
ميانه سن در گروه شاهد و بيماران مبتلا به كـرون بـه ترتيـب 31 سال (62-17 سال) و 32 سال (65-16 سال) بود.
نسـبت مـرد بـه زن در هـر دو گـروه مطالعـه 6/1 بـه 1 بـود.
خصوص يات ب ـاليني بيمــاران ب ر اس اس طبق ـهبن ـدي وي ـن در جدول 2 خلاصه شده است.
در مجموع 420 آلل ژن NOD2 در 90 بيمار مبتلا به كـرونو 120 شاهد سالم جهت يافتن هر تغييـر در نوكلئوتيـدها بـهروش sequencing مستقيم بررسي گرديد. در مناطق اگزوني اين ژن، 21 موتاسيون در اگزون هاي 2، 4، 8 و 11 يافت شـد (جدول 3). در ساير اگزون هاي بررسي شده در مطالعه ما هيچ جهشي مشاهده نگرديد.
بيش از 70% جهـش هـا (16(n= در اگـز ون 4 متمركـز شـدهبودند. ساير جهش ها به ترتيب 2 عدد در اگزون 2، 2 عـدد دراگ زون 8 و ي ك جه ش در اگـزون 11 قـرار داش تند. تمـام جه ش ه ا ناشـي از جابجـايي يـك نوكلئوتيـد بودن د ، بج ز جهــش SNP13) 1007fsinsC) كــه ناشــي از ورود يــك
جدول 1- پرايمرهاي استفاده شده در PCR اگزونهاي ژن NOD2

قطعه

اندازه
PCR

پرايمرها

اگزون

Forward
Reverse

قطعه

اندازه

PCR

پرايمرها

اگزون



قیمت: تومان

دسته بندی : پزشکی

دیدگاهتان را بنویسید