بررسي سازوکار اثر منبع نيتروژن موجود در محيط کشت روي pH محيط و توليد پلي گاماگلوتامات توسط فلاووباکتريوم
اسماء چگني، علي بهرامي*+، مجتبي خاني
تهران، دانشگاه صنعتي مالک اشتر، پژوهشکده علوم و فناوري زيستي، گروه مهندسي شيمي
محمد داوود غفاري
تهران، دانشگاه آزاد اسلامي، واحد تهران شمال، باشگاه پژوهشگران جوان
چكيده: پلي گاماگلوتامات، زيست پليمر پلي آميدي متشکل از واحدهاي گلوتاميک اسيد است که به علت خاصيت زيستتخريبپذيري و غير سمي بودن بهعنوان يک ترکيب زيستي ميتواند در بسياري از زمينهها همچون پزشکي و دارورساني، غذايي، هيدروژلها، لخته سازهاي زيستي، جاذبهاي رطوبت، تغليظ کنندهها و پوششهاي ضد خوردگي مورداستفاده قرار گيرد. به اين ترتيب براي بهينهسازي توليد آن، در اين پژوهش ابتدا تأثير غلظت منبع نيتروژن بهعنوان يک منبع تغذيهاي مهم روي pH محيط و ميزان رشد سلولي موردبررسي قرار گرفت و سپس چگونگي سازوکار تأثيرگذاري روي توليد پلي گاماگلوتامات از گونهي فلاووباکتريوم بررسي شد، و سرانجام براي بهينهسازي منبع نيتروژن، پنج منبع نيتروژني گوناگون )به روش آماري تک فاکتوريلي( ارزيابي و سديم گلوتامات با بيشترين مقدار توليد )7/32 گرم بر ليتر( و همچنين ارزان و در دسترس بودن بهعنوان منبع نيتروژن انتخاب شد.
واژههاي كليدي: زيست پليمر؛ پلي گاماگلوتامات؛ گلوتاميک اسيد؛ تغيير pH ؛ فلاووباکتريوم؛ منبع نيتروژن.
KEYWORDS: Biopolymer; Poly(gamma)glutamate; Glutamic acid; pH Change;Flavobacterium sp.;
Nitrogen source.
مقدمه
باکتريها ميتوانند طيف گستردهاي از زيستبسپارها که در هزينههاي پايين توليد شوند. از ميان پليمرهاي باکتريايي، با وظيفههاي زيستي متنوع، که داراي ويژگيهاي مادي مناسب تنها چند پليمر بهصورت درون سلولي توليد ميشوند [2، 1]، اما گروه براي بسياري کاربردهاي صنعتي و پزشکي هستند را توليد کنند. گستردهاي از اين دست پليمرها بهصورت خارج سلولي تهيه ميشوند.
بااينحال، زيستبسپارها زماني ازلحاظ اقتصادي مناسب هستند بااينحال، زيستبسپارهاي بهدستآمده از منابع طبيعي برتريهاي

+E-mail: [email protected] عهده دار مکاتبات *
87
1397-185570

شکل 3ـ ساختار کلي يک زنجيره پلي آميدي [6].

قابلرقابتي، بهواسطه توليد پايدارشان از منابع تجديد پذير، خاصيت زيستتخريبپذيري و زيست سازگاريشان)1( در مقايسه با پليمرهاي مصنوعي دارند .افزون بر اين زيستبسپارها از مواد غير سمي طبيعي تشکيلشدهاند و به طور ذاتي زيست سازگار در نظر گرفته ميشوند [3].
پلي آميدها ،پليمرهاي سنتزي شامل پيونددهندههاي آميدي هستند ،بهطوريکه توسط واکنش تراکمي بين يک گروه آمينو و يک بخش از گروه کربوکسيل تشکيل ميشوند )شکل 1( [4]. طول زنجيرهي کربني بين پيوندهاي آميدي) اغلب 2 تا 12( بهشدت روي ويژگيهاي پلي آميد به دست آمده تأثيرگذار است [5].
پلي آميدهاي تهيه شدهي غير ريبوزومي گروه مجزايي از زيست پليمر شامل:
 دو نوع پلي آميد خارج سلولي:
پلي گاما گلوتامات)2( )PGA(
اپسينون پلي ال لايزين)3( )PL(
 يک نوع پلي آميد داخل سلولي:
سيانوفسين پپتيد گرانول)4( )CGP(]7[ PL از خود ويژگيهاي آنتي باکتريايي نشان داده است، PGA نيز ميتواند در هر دو شکل ترشحشده يا کپسولي وجود داشته باشد .
ويژگيهاي شيميايي PGA و CGP ها با مقداري کاهش در ميزان آرژنين همانند ويژگيهاي پلي آکريلات تهيه شدهي شيميايي با کاربرد گسترده است [9 ـ 7]. از اينرو پلي آمدهاي باکتريايي ميتوانند جايگزين تجديد پذير، غير سمي و تجزيهپذير زيستي براي پلي آکريلاتها باشند [11، 11].
پلي گاماگلوتامات ،فراورده پيوند آميدي گاما ـ کربوکسيل و آلفا آمين بين ايزومرهاي L و D گلوتاميک اسيد است [12].
براي توليد پلي گاماگلوتاميک اسيد صورت گرفته است [13]. همکاران در سال 1391 ميلادي در پايگاه دادهي NCBI ثبت شده [15، 14]

)1( Biocompatibility )2( ε-poly-l-lysine
)3( Poly-γ-glutamate )4( CyanopHycin granule peptide
88
پژوهشهاي گستردهاي بر روي سويههاي زيادي از باسيلوس ها
با توجه به مطالعههاي انجام شده روي توليد اين زيست پليمر از اين سويه توسط بهرامي و همکاران [14] و همچنين خاني و همکاران [15] در سالهاي گذشته، بررسي سازوکار تأثير منبع نيتروژن روي توليد اين زيست پليمر در محيط کشت توليد و pH محيط، لازمهي تکميل اين مطالعهها ميباشد. از سوي ديگر با توجه به بهينهسازيهاي انجام شده روي ترکيب محيط کشت و تعيين مقدار بهينه منبع نيتروژن مورد نياز اين سويه و انجام طرحهاي آماري، در اين پژوهش براي صنعتي کردن فرايند به روش تک فاکتوريل منبعهاي نيتروژني جايگزين در همان مقدار بهينه مورد بررسي قرار گرفتند.
امروزه بيشتر مطالعهها بر روي توليد پلي گاماگلوتامات با استفاده از سويههاي وابسته به گلوتامات خارجي متمرکزشدهاند .
در اين پژوهش هدف، بهينهسازي توليد پلي گاما گلوتامات (PGA) از گونه فلاوباکتريوم است که پتانسيل مناسبي در توليد اين زيست پليمر داشته و توليد خارج سلولي دارد، اما تاکنون بهينهسازي و بررسي ميزان توليد با منابع و نيتروژني گوناگون در مورد آن صورت نگرفته است. به همين منظور براي بهينهسازي شرايط توليد زيست پليمر ميکروبي توليدي از اين سويه ابتدا مقدار غلظت منبع نيتروژن و تأثير آن روي pH محيط و ميزان رشد سلولي بررسي شد و سپس منبع نيتروژن گلوتاميک اسيد با منابع نيتروژني ارزانتر مانند سديم گلوتامات، اوره، سديم نيتريت، نيترات پتاسيم شد و آمونيوم کلريد در شرايط بهينه جايگزين شد و سرانجام مقدار وزن خشک فراوردهي توليدي و کيفيت آن موردبررسي قرار گرفت.

نوآوري پژوهش
سويه مورد استفاده در اين پژوهش براي اولين بار توسط بهرامي و
و اين پژوهش اولين گزارش مبني بر بهينهسازي توليد اين زيست پليمر به واسطهي بررسي تأثير منبع نيتروژن از اين سويه ميباشد.

بخش تجربي سويه ميکروبي
سويه باکتري مورداستفاده در اين پژوهش يک باکتري هوازي، غيراسپورزا و گرم منفي ميباشد که از خانواده فلاووباکتريوم ها)1( بوده و در پژوهشهاي گذشته پژوهشکده علوم و فناوري زيستي دانشگاه صنعتي مالک اشتر جداسازي شده است]14[. اين سويه با نام کرايزئو باکتريوم ايندولوجنس MUT2 در پايگاه داده (JN831444) NCBI ثبتشده است]14[.

پيش کشت ميکروبي
از محيط عمومي ال بي براث)2( براي تهيهي مايهي تلقيح استفادهشده است. بدين منظور يک ميليليتر از بانک ميکروبي 01- درجه سلسيوس به 151 ميليليتر ال بي براث سترون افزوده شد و به مدت 12 ساعت در همزن انکوباتور در دماي 31 درجه سلسيوس و با دور rpm 171 قرار گرفت [11].

محيط کشت اختصاصي توليد زيست پليمر
محيط کشت بهينهشده )گرم بر ليتر( شامل ساکاروز: 21،
MgSO4.7H2O1، /7 :NH4Cl ،1 :K2HPO4 ،9 :NaH2PO4.H2O : 1 در غلظت ياد شده در آب مقطر حل شد )براي حجم 111 ميليليتر تهيه شد(. ترکيب محيط کشت مورداستفاده در پژوهش پيشين بهرامي و همکاران بهينهشده است [15].

تهيه محيط کشت توليد جهت انتخاب نوع منبع نيتروژن
-347971574907

پنج منبع نيتروژن بهعنوان جايگزيني براي گلوتاميک اسيد شامل ،سديم گلوتامات، اوره، سديم نيتريت، پتاسيم نيترات و آمونيوم کلريد در نظر گرفته شدند .ازآنجاييکه در محيط کشت بهينهشدهي پيشين، بهينه منبع نيتروژن افزودهشده براي 1111 ميليليتر محيط کشت 71/1 گرم بود ازاينرو بنا بر محاسبههاي صورت گرفته براي ارلنهاي 111 ميليليتري محيط اختصاصي از پيش تهيهشده به ترتيب گلوتاميک اسيد 54/5 گرم، سديم گلوتامات
)2( Maillard

15/7 گرم، اوره 13/1 گرم، سديم نيتريت 1/2 گرم، پتاسيم نيترات
01/3 گرم و آمونيوم کلريد 11/2 گرم افزوده شد. محلول بهدستآمده به علت غلظت بالاي منابع نيتروژني ياد شده pH اسيدي حدود 5/3 خواهد داشت که ميبايست در حالت خنثي يعني روي 7 تنظيم شود. با توجه به اينکه اتوکلاو کردن ساکاروز همراه با ديگر ترکيبهاي محيط کشت باعث تغيير رنگ محيط کشت و از دست رفتن کيفيت مواد مغذي آن ميشود )واکنش قهوهاي شدن از نوع ميلارد)3(( ]17[ در چنين شرايطي براي حل مشکل، محلول ساکاروز غليظ251 گرم بر ليتر تهيهکرده و بهصورت جداگانه اتوکلاو و به اجزاي محيط کشت افزوده شد [10]. همچنين در پايان سيتريک اسيد در غلظتي همانند گلوتاميک اسيد به محيطها بهعنوان پيش ساز اضافه شد.

تلقيح محلول ساکاروز و مايه تلقيح به محيط کشت
با توجه به اينکه در هر ارلن نيم ليتري به ميزان
111 ميليليتر محيط پايه توليد تهيهشده، پس از اتوکلاو نمودن محيطهاي مربوطه، در هر ارلن به ميزان 2/25 ميليليتر از محلول غليظ ساکاروز) 251 گرم بر ليتر( سترونشده در شرايط استريل و زير هود ميکروبي افزوده شد. در پايان ميزان )v/v( %1 پيش کشت ميکروبي به ارلنها افزوده شد ]19[.

استخراج فراورده
ارلنها به مدت 91 ساعت، در دماي 31 درجه سلسيوس و دور rpm171 قرار گرفت [15]. از انکوباتور خارج و ازآنجاييکه هر ارلن داراي محيط کشت، توده سلولي و فراورده بود، سلولها بهوسيلهي سانتريفيوژ )شرکت سيگما مدل 6-K16 با شماره روتور Nr.12256 ( جداسازي شدند. سپس به هرکدام از مايعهاي رويي جداشده بهاندازهي سه برابر حجمي اتانول مطلق 91% افزوده شد .
و در يخچال 4+ درجه سلسيوس قرار داده شد. پس از حدود 12 ساعت فراوردهي زيست پليمر در کف ظرفهاي استخراج رسوبکرده بود. ظرفهاي استخراج از يخچال بيرون آورده شد و تا حد امکان، از مايع بالايي خارج شد و باقيمانده ته هر ظرف سانتريفيوژ شد تا زيست پليمر بهطور کامل از الکل جدا شود.
فراورده بهدستآمده در محيط آزمايشگاه گذاشته شد تا به طور کامل خشک شود [15].
)1( Flavobacterium
)3( LB Broth
89
21243-199540

شکل 2ـ مسير متابوليکي پيرويک اسيد [39].

نتيجهها و بحث
بهطور خلاصه نيتروژن يک محرک مثبت براي توليد زيستي پلي گاماگلوتامات بود و کاهش منبع نيتروژن روي مسيرهاي سوخت و سازي شامل گليکوليز ،سوخت و ساز همجرياني و سوخت و ساز انرژي تأثيرگذار است]21[. همانگونه که در سوخت و ساز پيروات) شکل 2( روشن است که، فومارات و لاکتات با کاهش منبع نيتروژن افزايش مييابد درحاليکه تهيه 2 و 3 بوتان دي ال کاهش مييابد. مطالعههاي پيشين نشان ميدهند که بهترين منبع نيتروژن در محيط تخمير پلي گاماگلوتامات ،گلوتاميک اسيد بوده که منبعي بسيار گران و دور از دسترس است]15[. نيتروژن يک ترکيب زيستي فعال مهم در سلول است و سه عمل زيستي را در سلول بر عهده دارد: الف( بهعنوان منبعي براي رشد سلول عمل ميکند ب(پذيرنده نهايي الکترون براي توليد انرژي است و ج( سبب اتلاف مقدار اضافي انرژي براي موازنه فرايند اکسايش احيا ميشود که ،افزون بر اين موارد روي سوخت و ساز اسيدهاي آلي هم تأثيرگذار است]19[ .
سويههاي مستقل از گلوتامات براي توليد پلي گاماگلوتامات بايد گلوتامات را درون سلول تهيه کنند. بنابراين، سطح گلوتامات داخلي ميتواند عامل کليدي در محدود کردن توليد در سويههاي )شکل 3(. بنابراين اين امر ميتواند بيانگر اين باشد که دستيابي به حد واسطهاي چرخهي سيتريک اسيد )مانند سيتريک اسيد ،مالئيک اسيد يا سوکسينيک اسيد( ميتواند ميزان تأمين آلفاکتوگلوتارات را در گونههاي مستقل از گلوتامات افزايش دهد که درنتيجه آن توليدگلوتامات مونومر تشکيلدهندهي زيست پليمر پلي گاماگلوتامات نيز افزايش مييابد [13].
پلي گاما گلوتامات پليمري پلي آنيونيک است که ممکن است از انانتيومرهاي L،D ويا هردوي آنها تشکيلشده باشد. بسيار محلول است و ميتوان با الکتروفورز روي کاغذ آن را از ديگر ترکيبهاي طبيعي جدا کرد [22].

تأثير غلظت منبع نيتروژن روي توليد زيستي پلي گاماگلوتامات
افزودن منبع نيتروژن به محيط کشت بهطور مؤثري توليد زيستي پلي گاماگلوتامات را افزايش ميدهد. همانگونه که در شکل 4 نشان دادهشده است توليد پلي گاماگلوتامات با افزايش غلظت منبع نيتروژن مورداستفاده در مطالعههاي پيشين بهرامي و همکاران )گلوتاميک اسيد( تا 21 گرم بر ليتر افزايش مييابد ]15, 14[ و همچنين فراوردهي به دست آمده کيفيت دلخواهتري ازنظر رنگ و نوع عملکرد دارد.
مستقل باشد. گلوتاميک اسيد از آلفاکتوگلوتارات به دست آمده
از چرخهي سيتريک اسيد مشتق ميشود. منبع کربن طي گليکوليز تأثير منبع نيتروژن روي رشد سلولي و pH در حين تخمير پلي به پيروات تبديلشده که سپس پيرووات طي چرخهي سيتريک اسيد گاماگلوتامات
به آلفاکتوگلوتارات مصرف ميشود. از سوي ديگر، آلفا کتوگلوتارات ميزان زيست توده وpH ، دو شاخص اساسي براي رشد سلوليبه صورت مستقيم پيش ساز گلوتامات بوده که سرانجام، چرخهي و فعاليت آن هستند. شکل 5 نشان ميدهد که عملکرد رشد سلوليسيتريک اسيد را به توليد زيستي پلي گاماگلوتامات مرتبط ميکند در محيط کشتهاي با و بدون منبع نيتروژن در مرحلههاي اوليه
99

شکل

4
ـ

مس
ي
ر

متابول
ي
ک
ي

زيستي
توليد

گلوتام
ي
ک

اس
ي
د

]
23
[
.

شکل

4

ـ

مس



قیمت: تومان

دسته بندی : شیمی و مهندسی شیمی

دیدگاهتان را بنویسید