مهندسي شيمي ايران کوتاه پژوهشي دوره 43، شماره

ابداع روشي کمهزينه و دقيق براي خالصسازي فاکتور رشد اپيدرمي انساني نوترکيب (hEGF)

فاطمه خدارحمي، سيد عباس شجاعالساداتي*+
تهران، دانشگاه تربيت مدرس، دانشکده مهندسي شيمي، گروه بيوتکنولوژي، صندوق پستي 111 ـ 11111

رسول خليلزاده، جعفر محمديان
تهران، دانشگاه صنعتي مالک اشتر، پژوهشکده علوم و فناوري زيستي

چكيده:فاکتور رشد اپيدرمي)EGF( انساني با 15 اسيدآمينه و وزن مولکولي 2/6 کيلو دالتون، پروتئيني با قابليت تحريک رشد چندين نوع سلول است و به دليل همين ويژگي در موارد پزشکي و تهيه فراوردههاي آرايشي کاربردهاي بسياري دارد. در اين پژوهش، ابتدا پلاسميد pET23a(+) حاوي ژنEGF به باکتري اشرشياکلي سويه BL21(DE3) منتقل شد که سويه نوترکيب به دست آمده قادر به توليد فاکتور رشد اپيدرمي انساني به صورت درونريز بود. روند خالصسازي استفاده شده در اين پژوهش، روشي آسان و به صرفه و داراي سه مرحله اصلي شامل بازکردن تاخوردگي مولکولي و واسرشتگي مولکولها ،خالصسازي پاياني به روش فراتصفيه و ايجاد تاخوردگي دوباره مولکولهاي جداشده ميباشد. در اين پژوهش، از روش کروماتوگرافي مايع با کارايي بالا در ستون فاز وارون در کنار آزمايش SDS-PAGE براي سنجش نتيجههاي مرحلههاي گوناگون خالصسازي استفاده شد .
درآخرين مرحله خالصسازي نتيجههاي هردو آزمايش نشاندهنده خلوص بالا براي پروتئين جداشده ميباشد.

واژههاي كليدي: فاکتور رشد اپيدرمي انساني، خالصسازي، نوترکيب، اشرشياکلي، فراتصفيه، تا خوردگي دوباره.

KEY WORDS: Recombinant human epidermal growth factor (rhEGF); Purification; Recombinant
Escherichia coli; Ultrafiltration; Refolding.

مقدمه
فاکتور رشد اپيدرمي انساني(hEGF)، پليپپتيد تک زنجيرهاي سلولهاي مخاطي قرنيه، ششها و ناي را تحريک م يکن د ]0 ، 6[.
کوچکي با وزن مولکولي 1026 دالتون و 35 اسيدآمينه ميباشد و اي ن پ روتئين در ح ال حا ر ب ه ن وان ي ک داروي مناس ب يکي از پروتئينهايي است که قابليت توليد آن به صورت نوترکيب براي درمان سوختگيها، مله ا ي جراح ي و درم ان مص دومان وجود دارد. در شرايط برونتني فاکتور EGF انساني يک بهکار ميرود و پيشبيني ميشود در آينده، کاربرد گستردهاي را آغازگر قوي براي بيشتر سلولها با منشاء اپيدرمي بوده و ب راي ت رميم باف ته اي مخ اطي و تولي د ل وازآ آرايش ي در شرايط درونتني اين فاکتور تکثير و تمايز بافت پوست و داشته باشد ]0[.

+E-mail: [email protected] عهده دار مکاتبات *
333
خالصسازي بهکار برده شده است .هدف از اين پژوهش، ابداع روش ملي و بهصرفهاي براي خالص سازي اين پروتئين بود که کارايي لازآ را هم داشته و ميزان خلوص قابل قبولي را براي پروتئين مورد بحث ارايه دهد.

بخش تجربي
ميزبان، پلاسميد و ژن
ميزبان استفاده شده براي توليد فاکتور رشد اپيدرمي انساني تاکنون پژوهشهاي زيادي در مورد بيان، خالصسازي و توليد اين پروتئين انجاآ شده است و فناوريهاي گوناگوني براي توليد آن به کار رفته است. اين پروتئين در سامانههاي بياني ريزسازوارهها مانند اشرشياکلي و قارچها بيان شده است .پروتئين EGF انساني، اولين بار در سال 6610 ميلادي توسط کوهن معرفي شده است .
در سال 6695 ميلادي ژن EGF انساني ساخته شده و در سال
6691 ميلادي پيشساز آن کلون و بيان شده است ]1 6[.
در سال 6693 ميلادي، مونت و همکاران، براي جداسازي
پروتئين hEGF از ادرار انساني، روش جذب چند مرحلهاي را (hEGF)، سويه (BL21(DE3 باکتري اشرشياکلي بود که پس از بر روي ستونهاي کروماتوگرافي گوناگون و سرانجاآ سه مرحله انتقال پلاسميد pET23a(+) حاوي ژنEGF ، بهصورت نوترکيب کروماتوگرافي فاز وارون مايع با کارايي بالا، به منظور دستيابي درآمد.
به تخليص کامل بهکار بردند]7[. در پژوهش ديگري که توسط
جونگ لي و همکاران در سال 0222 ميلادي انجاآ گرفت، پروتئين محيط کشت
hEGF به روش کروماتوگرافي مايع با کارايي بالا و کروماتوگرافي براي نگهداري، تهيه و آزمايش اوليه سويهها، از محيط کشت مايع پروتئين با سر ت بالا، جدا و خالصسازي شد]9[. يون لي و پيچيده LB به صورت مايع و جامد استفاده شد.
همکاران در سال 0225 ميلادي، جداسازي و خالصسازي hEGF
از محيطکشت باکتري اشرشياکلي نوترکيب را با استفاده از گسستن ديواره سلولي
کروماتوگرافي جذبي روي بستر توسعه يافته و کروماتوگرافي مايع محيط کشت حاوي باکتري نوترکيب با سر ت 3222 دور بر دقيقه با کارايي بالابررسي کردند]6[. در پژوهش ديگري که در سال به مدت 9 دقيقه در C°4، سانتريفوژ شد. سلولهاي تهنشين شده 0225 ميلادي توسط سولرا و همکاران انجاآ گرفت، پروتئين در بافر فسفات 32 ميليمولار با 7/4=EDTA ،pH و PMSF، hEGF پس از توليد در باکتري اشرشياکلي نوترکيب به دو روش در دماي C°4 به صورت تعليق يکنواخت درآمد. براي مل تخريب کروماتوگرافي مايع به صورت شويشي با تغيير شيب و کروماتوگرافي ديواره سلولي به روش فراصوتي از دستگاه مولد امواج فراصوت
تمايلي بهصورت شويشي با تغيير شيب خالصسازي شد ]3[.
بدل ر يص و همکاران پژوهش ديگري را در سال 0221 ميلادي انجاآ دادند که در آن ،hEGF ترشح شده از باکتري اشرشياکلي نوترکيب به درون محيط کشت ابتدا به وسيله شوک اسمزي جدا و سپس با استفاده از يک کيت آماده داراي ليگاند و به روش کروماتوگرافي تمايلي جداسازي شد]6[.
شارما و همکاران در سال 0229 ميلادي، hEGF را در باکتري اشرشياکلي نوترکيب بيان کرده و به صورت توده پروتئيني نامحلول توليد کردند. اين پژوهشگران براي خالصسازي بهترتيب از روشهاي کروماتوگرافي تعويض يوني و کروماتوگرافي مايع با کارايي بالا با ستون فاز وارون استفاده کردند]62[.
روشي که براي خالصسازي پروتئين فاکتور رشد اپيدرمي انساني
332
انتخاب ميشود در ميزان قيمت تماآ شده پروتئين به دست آمده از اهميت بالايي برخوردار است. در تمامي روشهايي که تاکنون گزارش شدهاند ،يکي از انواع کروماتوگرافي در مرحلههاي
مدل WUC-D10H با توان 162 وات استفاده شد.

شستوشو و حل کردن تودههاي پروتئيني
تهماند به دست آمده پس از مرحله تخريب سلولي 4 مرتبه با بافر فسفات حاوي %5 حجمي حجمي تريتون 622-X شستوشو داده شد. در هر مرحله مخلوط پس از همگن شدن به کمک همزن مکانيکي به مدت 63 الي 02 دقيقه در دماي محيط
قرار گرفته و سپس با سر ت 62222 دور بر دقيقه به مدت 02 دقيقه و در دماي C°4 سانتريفوژ شد. در مرحله بعد، تهماند به دست آمده از آخرين مرتبه شستوشو با تريتون 622-X، با بافر فسفات داراي اوره 5 مولار شسته شد. سرانجاآ پس از قرار دادن تودههاي مجاور شده با اوره 5مولار به مدت 63 دقيقه در دماي محيط ،تعليق بهدست آمده با سر ت 62222 دور در دقيقه به مدت 02 دقيقه و در دماي C°4 سانتريفوژ شد. به منظور حل کردن تودههاي پروتئيني از اوره 9 مولار استفاده شد .براي شفافسازي محلول از صافي آميکون با برش حذف برابر با KD622 استفاده شد. بهمنظورجلوگيري از بههم پيوستن مولکولهاي پروتئين از ديتيوتريتول )DTT( استفاده شد ]65-66، 9[.

فراتصفيه
محلول شفاف به دست آمده از صاف کردن مرحله پيشين، به درون لولههاي صافيدار )سامانهاي معروف به سنتريکون( با برش حذف برابر با KD 5، ريخته و با سر ت 1222 دور در دقيقه در دماي C°4 و به مدت 52 دقيقه سانتريفوژ و به صورت همزمان صاف و جداسازي شد. در ادامه روند فراتصفيه، نمونه رقيق شده به درون لولههاي صافيدار با برش حذف برابر با KD62، ريخته و با سر تهاي 9222، 6222 و 62222 دور در دقيقه در دماي C° 4 و به مدت 52 دقيقه سانتريفوژ و به صورت همزمان صاف و جداسازي شد.

سنجش نتيجههاي مرحلههاي گوناگون خالصسازي
براي تعيين ميزان بيان و خلوص در مرحلههاي گوناگون خالص سازي فاکتور رشد اپيدرمي انساني در سلولهاي نوترکيب ،از روش الکتروفورز با ژل اکريلآميد% 63 در حضور سديم دودسيل سولفات (SDS-PAGE) استفاده شد. آخرين مرحله بررسي خلوص پروتئين hEGF نوترکيب، استفاده از روش کروماتوگرافي مايع با کارايي بالا در فاز وارون بود. براي اين منظور از ستون 69C فاز وارون )SIGMA( در دستگاه (UV 7300)Younglin Instrument استفاده شد. بافرهاي مورد استفاده براي انجاآ کروماتوگرافي محلولهاي %6)v-v( تريفلورو استيک اسيد )TFA( در آب دوبار تقطير بدون يون و% 6)v-v( تريفلورو استيک اسيد در استونيتريل بودند. در اين مورد، از روش تجزيه شويشي با تغيير شيب به اين ترتيب استفاده شد که در ابتداي آزمايش ،
فاز متحرک با نسبت 622 به 2 به ترتيب از محلول %6 تريفلورو استيک اسيد در آب و محلول %6 اسيد تريفلورو استيک در استونيتريل آغاز و پس از گذشت مدتزمان 32 دقيقه با وارون اين نسبت به پايان رسيد.

براي ايجاد دوباره تاخوردگي در مولکول پروتئين، محلول از سديم دودسيل سولفات نيز استفاده شد اما به دليل ايجاد مشکلاتي سيستئين باغلظت mM 3 به محلول به دست آمده از فراتصفيه در جداسازي اين شوينده از توده نامحلول پروتئيني و دست نيافتن به خلوص افزوده شد، پس از گذشتن مدت زمان 6 سا ت در دماي محيط ، مناسب براي پروتئين مورد بحث، اين شوينده مورد استفاده قرار نگرفت.
334
بازيابي شکل فضايي پروتئين

شکل 3ـ نتيجه آزمايش الکتروفورز سلولهای نوترکيب و غيرنوترکيب باکتری پس از گسستن ديواره سلولي ،3و 2: باکتری نوترکيب با تزريق 22 و 32 ميکروليتر ،4 و 3: باکتری غيرنوترکيب با تزريق 22 و 32 ميکروليتر و 5: نمونه hEGF استاندارد.

سيستين با غلظت mM 3 به محلول بالا افزوده شد و بهمدت 04 سا ت در دماي محيط قرار گرفت]9[.

نتيجهها و بحث
پس از اطمينان از بيان مناسب پروتئين hEGF بهوسيله القاگر IPTG در باکتري اشرشياکلي نوترکيب به روش انجاآ آزمايش الکتروفورز SDS-PAGE که نتيجه آن در شکل 6 ديده ميشود ،ديواره سلولي گسسته و توده نامحلول پروتئين به صورت تعليق يکنواخت در بافر فسفات درآمد.

مرحله شستوشو و حلکردن توده نامحلول پروتئيني
در ادامه و در مرحله بعدي، توده نامحلول پروتئيني با مواد واسرشته کننده با غلظت بالا حل شد. در اين پژوهش با استفاده از تريتون622-X با غلظت% 5 در بافر فسفات ،همراه با شستوشو بخش چشمگيري از آلودگيها و بهويژه چربيهاي غشايي حل شده و به صورت روماند از محيط خارج شد .نتيجههاي چهار مرحله شستوشوي توده نامحلول پروتئيني با اين ماده فعال سطحي غير يوني در شکل0 آورده شده است.
گفتني است که براي شکستن ديواره سلولي و حذف چربيها

EGF

(
6
/
2

KD)



قیمت: تومان

دسته بندی : شیمی و مهندسی شیمی

دیدگاهتان را بنویسید