شیمی

بررسی ترکیبهاي تشکیل دهنده، فعالیت ضد میکروبی ، آنتی اکسیدانی و محتواي فنولی روغن اسانسی به دست آمده
از اندام هوایی گیاه Phlomis aucheri Boiss رویشی در ایران

محبوبه طاهرخانی*+
تاکستان، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تاکستان، دانشکده علوم پایه، گروه شیمی

شیوا مسعودي، مهدي کرمینیا
تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران مرکز، دانشکده علوم پایه، گروه شیمی

عبدالحسین روستائیان
تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشکده علوم پایه، گروه شیمی

چکیده: جنس Phlomis ، از خانواده نعنائیان Labiatae ، در ایران 17 گونه گیاهی دارد. اندام هوایی گیاه Phlomis aucheri Boiss با شماره هرباریومی ((Herbarium No: 91021, TARI و با نام فارسی گوش بره ایرانی، گوش بره زرد، که بومی ایران می باشد از دامنه هاي کوه منطقه شهران، واقع در استان تهران جمع آوري شد. در این کار پژوهشی ترکیبهاي تشکیل دهنده اسانس اندام هوایی گیاه p. aucheri به روش تقطیر با آب استخراج شد و توسط دستگاه هاي GC و GC/MS مورد آنالیز و بررسی قرار گرفت. 47 ترکیب با درصد 88 /92% شناسایی شد، که از این میان (58/24%) E-anethole و (10/11%) germacrene D عمده بودند. سایر ترکیبهاي شایان توجه عبارتند از: (3/6%)bicyclogermacrene، (01/6%)neryl acetate(%4/58) ، β-caryophyllene(%5/58) ،spathulenol و (53 /4) germacrene B. بخش عمده روغن
اسانسی این گیاه را سزکوئی ترپن ها با درصد (82/51%) تشکیل می دهند، در حالی که درصد مونو ترپن ها و ترکیبهاي غیر ترپنوئیدي در این روغن به ترتیب (32/13% و 74/27%) بوده است. خواص ضد میکروبی اسانس گیاه p. aucheri ، به دو روش سنجش قطر هاله مهار رشد بر روي محیط کشت مولر- هینتون آگار و روش غلظت بازدارندگی کمینه در برابر 6 باکتري گرم مثبت و منفی اندازه گیري شد. خواص آنتی اکسیدانی با سه روش بتا کاروتین زدایی، تعیین قدرت رادیکال زدایی DPPH و سنجش قدرت احیاي فریک (FRAP) با روش هاي استاندارد انجام شد. اسانس این گیاه خواص ضد میکروبی دلخواهی را در مقابل باکتري Bacillus anthracis از خود نشان داد. بررسی خاصیت آنتی اکسیدانی نشان داد که این گیاه می تواند به عنوان یک آنتی اکسیدان طبیعی عمل کند.

.Germacrene D، E-anethole، فعالیت ضد میکروبی ، Phlomis aucheri Boiss ،واژههاي کلیدي: روغن اسانسی

KEY WORDS: Essential oil, Phlomis aucheri Boiss, Antimicrobial activity, E-anethole, Germacrene D.

+E-mail: [email protected], [email protected] عهده دار مکاتبات *
علمی
مقدمه
جنس Phlomis ، از خانواده نعنائیان Labiatae، در ایران 17 گونه گیاه علفی چند ساله، با گل هاي فراهم و بیشتر درشت و زیبا دارد ، که از این میان 10 گونه انحصاري و بومی ایران است. اندام هوایی گیاه
(Herbarium No: با شماره هرباریومی Phlomis aucheri Boiss
(TARI ,91021 و با نام فارسی گوش بره ایرانی، گوش بره زرد ، نامیده میشود که بومی ایران می باشد. تاکنون گزارشی از بررسی روغن اسانسی گونه P. aucheri در مراجع دیده نشده است.
ترکیبهاي عمده موجود در اسانس به دست آمده از برگ گیاه P. fruticosa رویشی در یونان، (8/17%)germacrene D و (6/12%)γ -bisabolene میباشد [1].
در حالی که در روغن اسانسی گیاه P. lanata رویشی در یونان، (4/25%)α -Pinene و (7/15)limonene عمده هستند [2] . در سال 2005 میلادي ،اسانس به دست آمده از کل اندام هوایی
همکاران
در استان تهران جمع آوري شد و در هواي آزاد و سایه خشک شد. نمونه هرباریومی آن توسط هرباریوم مؤسسه جنگل ها و مراتع مورد شناسایی قرار گرفت. سپس حدود 50 گرم از کل اندام هوایی آن به روش تقطیر با آب و به مدت 3 ساعت در دستگاه کلونجر اسانس گیري شد.

ب ـ جداسازي و شناسایی ترکیبهاي تشکیل دهنده
براي شناسایی ترکیبهاي اسانس از دستگاه هاي کروماتوگرافی
گازي (GC) و کروماتوگرافی گازي متصل به طیف سنج جرمی (GC/MS) استفاده شد. پس از تزریق اسانس به این دستگاهها، اندیس بازداري کواتس (KI) براي تمام ترکیبهاي محاسبه شد و با مقایسه این اندیس ها با شاخص هاي بازداري استاندارد به شناسایی ترکیبهاي تشکیل دهنده روغن اسانسی پرداخته شد [4].

گیاهان P. persica و P. olivieri که بومی ایران میباشند ، ج ـ ویژگیهاي دستگاه کروماتوگرافی گازي
توسط روستائیان و همکاران مورد بررسی و شناسایی قرار گرفت [3]. دستگاه کروماتوگرافی گازي مورد استفاده در این پژوهش، به طوري که از آنالیز روغن اسانسی به دست آمده از اندام هوایی از نوع 6890 Agilent، با ستونی به طول30 متر، قطر داخلی گیاه P. persica ، ترکیبهاي (2/38%) germacrene D، 25/0 میلیمتر و با ضخامت لایه 25/0 میکرومتر و از نوع (3/16%) bicyclogermacrene و (3/13) α -Pinene به عنوان HP-5MS بود. برنامه دمایی ستون به این صورت تنظیم شد که ترکیبهاي عمده شناسایی شدند. همچنین از آنالیز روغن اسانسی دماي ابتداي آون 50 درجه سلسیوس و توقف در این دما به مدت و شناسایی مواد تشکیل دهنده به دست آمده از گیاه P. olivieri، 5 دقیقه، گرادیان دمایی 3 درجه سلسیوس در هر دقیقه، افزایش
ترکیبهاي (4/26%)bicyclogermacrene(%12/7) ، germacrene D دما تا240 درجه سلسیوس با سرعت 15 درجه در هر دقیقه ،به عنوان ترکیبهاي عمده شناسایی شد. افزایش دما تا 300 درجه سلسیوس و سه دقیقه توقف در این دما.
در این کار پژوهشی اندام هوایی گیاه P. aucheri در تیر ماه 1388، دماي اتاقک تزریق290 درجه سلسیوس بود و از گاز هلیم از دامنههاي کوهپایهاي منطقه شهران واقع در استان تهران به عنوان گاز حامل با شدت جریان 8/0 میلی لیتر در دقیقه جمع آوري شد. سپس ترکیبهاي تشکیل دهنده اسانس اندام هوایی استفاده شد. طیف نگار جرمی مورد استفاده مدل 5973Agilent گیاه P. aucheri به روش تقطیر با آب استخراج شد و توسط دستگاه هاي با ولتاژ یونیزاسیون 70 الکترون ولت، روش یونیزاسیون EI و دماي GC و GC/MS مورد آنالیز و بررسی قرار گرفت. در بخش بعدي منبع یونیزاسیون 220 درجه سلسیوس بود.
از این کار پژوهشی، خاصیتهاي ضد میکروبی اسانس گیاه P. aucheri ، به دو روش سنجش قطر هاله مهار رشد بر روي د ـ بررسی خواص ضدمیکروبی محیط کشت مولر- هینتون آگار و همچنین به روش غلظت خواص ضد میکروبی اسانس به دست آمده از اندام هوایی گیاه بازدارندگی کمینه در برابر 6 باکتري گرم مثبت و منفی اندازهگیري شد. P. aucheri ، به دو روش سنجش قطر هاله مهار رشد و روش غلظت بازدارندگی کمینه در مقابل 3 باکتري گرم مثبت استروپتوکوکوس
بخش تجربی پایوژنز ((RITCC، باسیلوس آنتراسیس ((RITCC، استافیلو الف ـ جمع آوري گیاه و استخراج کوکوس اورئوس ((RITCC، و سه باکتري گرم منفی کلبسیلا
اندام هاي هوایی گیاه P. aucheri ، در تیر ماه سال 1388 پنومونیه ((RITCC، اشریشیا کلی ((RITCC، از شمال ایران، از دامنه هاي کوهپایه اي منطقه شهران واقع پزودوموناس آئروژینوزا ((RITCC، اندازه گیري شد.

شیمیبررسی ترکیبهاي تشکله، فعالیت ضد میکروبی ،…
در روش سنجش قطر هاله مهار رشد ،باکتريهاي مورد بررسی در آب مقطر سترون حل شده و کدورت آب با شاهد 5/0 مک فارلند (10 میکروارگانیسم در هر میلی لیتر محلول) مقایسه شد.
سپس با سواپ سترون از باکتري ها برداشته شد و بر روي محیطهاي کشت سترون مولر هینتون آگار کشت داده شد ، در مورد باکتري استرپتوکوك پایوژنز از محیط کشت بلاد آگار استفاده شد. سپس گودال هایی بر روي محیط ایجاد شد. در ابتدا ته چاهک ها با 10 میکرولیتر محیط پر شد تا از نفوذ احتمالی اسانس ها به کف محیط جلوگیري شود و از بروز هر گونه خطا پیشگیري شود.50 میکرولیتر از اسانس مورد نظر به طور جداگانه
در چاهک ها ریخته شد و در هر ظرف کشت یک چاهک به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. ظرف هاي کشت شده مربوط به باکتريها در دماي 37 درجه سلسیوس به مدت 24-20 ساعت گرماگذاري شد و بعد از رشد، قطر هاله هاي مهار رشد مورد سنجش قرار گرفت. آزمایش ها سه بار تکرار شد.
در روش غلظت بازدارندگی کمینه (MIC)، محیط کشت مولر هینتون براث تهیه شد و در 10 لوله به مقدار مساوي 1 میلی لیتر
ریخته شد. پس از اتوکلاو و خنک شدن محیط ها، اسانس مورد بررسی با باکتريهاي یاد شده مورد آزمایش قرار گرفت. بدین روش 1 میلی لیتر از اسانس در لوله شماره 1 ریخته شد و بعد به طور پشتسر هم از لوله شماره 1 الی 11 با پیپت هاي جداگانه رقت تهیه شد، سپس 1/0 میلی لیتر از سوسپانسیون باکتري مورد نظر که با شاهد مک فارلند مقایسه شده بود، به هر لوله افزوده شد.
بدین ترتیب که لوله شماره 1 با بیشترین غلظت اسانس و اثر بازدارندگی و لوله شماره 11 با کمترین غلظت اسانس و اثر بازدارندگی بود. لوله هاي داراي اسانس و باکتري در انکوباتور 37 سلسیوس به مدت 24 ساعت گرماگذاري شده و نتیجهها پس از 24 ساعت بررسی و مقایسه شد [5].

ه ـ تعیین خواص آنتی اکسیدانی اسانس
خواص آنتی اکسیدانی با سه روش بتا کاروتین زدایی، تعیین قدرت رادیکال زدایی DPPH و سنجش قدرت احیاي فریک (FRAP) با روشهاي استاندارد انجام شد.

روش بتا کاروتین زدایی

در روش بتا کاروتن زدایی فعالیت آنتیاکسیدانی با استفاده از مهار ترکیبهاي آلی فرار و Conjugated diene hydroperoxides
روش توصیف شده به وسیلهي میرعلی اکبريو شهیدي با اصلاح جزئی استفاده شد [6]. محلول استوك بتاکاروتن و لینولئک اسید با 5/0 میلیگرم بتاکاروتن در یک میلیلیتر کلروفرم ، 25 میکرولیتر لینولئیک اسید و 200 میلیگرم توئین 40 آماده شد و کلروفرم در خلا تبخیر شده و به آن 100 میلیلیتر از آب هوادهی شده افزوده شد. نمونهها (2 گرم/ لیتر) حل شده و 350 میکرولیتر از آن به 2/5 میلیلیتر از مخلوط بالا، موجود درلولهها افزوده شد. لولههاي آزمایش به مدت 2 ساعت در حمام آب گرم با دماي 50 درجه سلسیوس همراه با دو تا نمونه شاهد گذاشته شدند. که یکی از آنها داراي آنتیاکسیدان BHT به عنوان کنترل مثبت و دیگري داراي DMSO به جاي اسانس به عنوان کنترل منفی بود. لولهي داراي BHT در طول انکوبه کردن رنگ خودشان را حفظ کردند. جذب در طول موج 470 نانومتر اندازهگیري شد فعالیت آنتی اکسیدانی نمونهها (درصد ممانعتکنندگی) با استفاده از رابطه زیر بهدست آمد [8 ، 7].
I% = (Aβ-carotene after 2h assay/ Ainitial β-carotene)
100 ×A-βcarotene after 2h assay جذب بتاکاروتن بعد از 2 ساعت باقی ماندن در نمونهها و Ainitial β-carotene و جذب بتاکاروتن در شروع آزمایشها میباشد. تمام آزمایشها سه بار تکرار شد و درصد ممانعت کنندگی با انحراف معیار سه تایی گزارش شد.

تعیین فعالیت رادیکال زداییبا آزمون DPPH
10 میکرولیتر اسانس با 900 میکرولیتر محلول 100 میلی مولار Tris-HClبا pH برابر با 4/7 ، 40 میکرولیتر اتانول و همچنین 50 میکرولیتر 20 TWEEN (5/0 درصد وزنی- وزنی) مخلوط شد.
این مخلوط به یک میکرولیتر (mM 5/0 برابر با mg/mL 2/0) DPPH در اتانول افزوده شد. مخلوط به شدت همزده شد و جذب با طول موج 517 نانومتر ثبت شد. ثبت تا 70 دقیقه ادامه یافت و نوسانها یادداشت شد تا جایی که دیگر نوسانی دیده نشد.
به جاي اسانس آب مقطر به عنوان شاهد استفاده شد و Trolox1Mm)) به عنوان آنتی اکسیدان پایدار استفاده شد [10 ، 9]. فعالیت رادیکال زدایی اسانس با رابطه زیر و بر اساس درصد ممانعت DPPH محاسبه شد:
Inhibition percentage (IP) = [(AB – AA)/AB] × 100
AB = Absorbance value of blank checked after 70 minutes
AA = Absorbance value of sample checked after 70 minutes
سنجش قدرت احیاي فریک(1)
یک میلی لیتر از رقتهاي گوناگون اسانس به 5/2 میلی لیتر بافر M2/0 پتاسیم فسفات با pH 6/6 و 5/2 میلی لیتر پتاسیم فري سیانید 1% افزوده شد و در دماي 50 درجه سلسیوس به مدت 20 دقیقه انکوبه شد. سپس 5/2 میلی لیتر تري کلرو استیک اسید 10% به آن افزوده شد. این ترکیب به چند بخش 5/2 میلی لیتري تقسیم شده و با 5/2 میلی لیتر آب دي یونیزه مخلوط شد. 5/0 میلی لیتر 3FeCl 1/0% (وزن/حجم) به هر کدام افزوده شد و پس از 30 دقیقه جذب در 700 نانومتر سنجیده شد.
آزمون FRAP به صورت معادل گالیک اسید (GAE) در mg/g نمونه محاسبه شد [11].

تعیین کل فلاونوئید ها
براي تعیین کل فلاونوئیدهاي موجود در اسانس گیاه ، 25/0 میلی لیتر از نمونه رقیق شده به یک لوله داراي یک میلی لیتر آب دوبار تقطیر شده افزوده شد. سپس 75/0 میلیلیتر از 5% 2NaNO و 075/0 میلی لیتر از 10% 3AlCl و 5/0 میلی لیتر از محلول یک مولار NaOH ، در زمان صفر و پنج و شش دقیقه پشت سر هم افزوده شدند. سرانجام حجم محلول واکنش به همراه آب دوبار تقطیر شده به میزان 5/2 میلی لیتر تنظیم شد. جذب محلول به وسیله اسپکتروفوتومتر در طول موج 510 نانومتر اندازه گیري شد، محتواي فلاونوئیدي موجود در هر عصاره گیاه بر اساس میلی گرم کاتچین هم ارز (CE) بر گرم عصاره گیاه بیان شد [12].

نتیجه ها و بحث
اسانس به دست آمده از اندام هوایی گیاه P. aucheri بهصورت روغن زرد روشن بود و بازده نسبت به وزن خشک گیاه (W/W) 21/0% بود. پس از تزریق نمونه به دستگاه کروماتوگرافی GC و GC/MS، با محاسبه و بررسی مؤلفههاي گوناگون مانند اندیسهاي بازداري کواتس و بررسی طیف هاي جرمی ترکیبهاي موجود در اسانس و مقایسه تمامی این مؤلفه ها با ویژگیهاي ترکیبهاي استاندارد به شناسایی اجزاي موجود در اسانسها اقدام شد. کلیه ترکیب هاي شناسایی شده در اسانس ها به همراه در صد نسبی و شاخص بازداري در جدول 1 قابل دیدن است.
-4267142649

همکاران
در اسانس گیاه، 47 ترکیب شناسایی شد که در مجموع 88/92 درصد از اسانس را تشکیل می دهند. از میان ترکیبهاي شناسایی شده، ترکیب غیر ترپنوئیدي (58/24%) E-anethole و همچنین سزکوئی ترپن هیدروکربنی (10/11%) germacrene D عمده بودند.
سایر ترکیبهاي شایان توجه عبارتند از سزکوئی ترپنهاي
(3/6%) spathulenol (%6/01) ،bicyclogermacrene، (58/5%) germacrene B (%4/53) ،β-caryophyllene و همچنین مونوترپن (58/4%) neryl acetate. بنابراین بخش عمده روغن اسانسی این گیاه را سزکوئی ترپن ها با درصد (82/51%) تشکیل میدهند.
در حالی که درصد مونوترپنها و ترکیبهاي غیر ترپنوئیدي در این روغن اسانسی به ترتیب برابر با (32/13% و 74/27%) بود
نتیجههاي به دست آمده از بررسی خواص ضد میکروبی اسانس
گیاه P. aucheri در مقایسه با جنتامایسین به عنوان استاندارد و به دو روش سنجش قطر هاله مهار رشد بر روي محیط کشت مولر ـ هینتون آگار و روش غلظت بازدارندگی کمینه، در جدول 2 آورده شده است.
اثر ضد میکروبی در مقابل 6 باکتري گرم مثبت و منفی اندازهگیري شد. مطابق با نتیجههاي به دست آمده ، اسانس این گیاه خواص آنتی میکروبی دلخواهی را در برابر باکتريهاي گرم مثبت
Bacillus anthracis و Staphylococcus aureus نشان میدهد. در صورتی که این اسانس در برابر باکتريهاي گرم منفی
Pseudomonas و Klebsiella pneumonia مورد آزمایش به ویژه .[13] بیاثر بوده است aeruginosa
مقدارهاي غلظت بازدارندگی کمینه و قطر هاله مهار رشد براي هر باکتري در جدول 2 آورده شده است.
خواص آنتی اکسیدانی با سه روش بتا کاروتین زدایی، تعیین
قدرت رادیکال زدایی DPPH و سنجش قدرت احیاي فریک (FRAP) با روش هاي استاندارد اندازهگیري شد. در روش بتا کاروتین زدایی به ازاي (mg/mL 625/0) اسانس، مقدار 5/2 ± 65/56 % به دست آمد. مقدار DPPH به ازاي (mg/mL 10) اسانس، برابر با 5/1 ± 6/63 % و میزان 50IC برابر با مقدار μg/mL 75/4 به دست آمد. قدرت احیاي فریک 5/0 ± 55/7 میلی گرم بر گرم معادل گالیک اسید به دست آمد.
محتواي کل فنلی معادل با 50/6 ± 60/146 میکروگرم گالیک اسید بر میلی گرم نمونه به دست آمد. مقدارهاي خواص آنتی اکسیدان و محتواي فنلی در جدول 3 آورده شده است.
(1) Ferric-reducing power assay (FRAP)

بررسی ترکیبهاي تشکله، فعالیت ضد میکروبی ،…
جدول 1ـ ترکیبهاي شناسایی شده اسانس اندام هوایی گیاه P. aucheri .

همکاران
جدول 3ـ نتیجههاي بررسی خواص آنتی اکسیدان و محتواي فنلی اسانس گیاه P. aucheri .
DPPH effect (%)

(
)
amount of essential oil

5
/
1

±

6
/
63

10
(
mg/m
L
)

DPPH (IC
50
)

75
/
4

μg/m
L

β

carotene

linoleic acid assay (amount of essential oil)

5
/
2

±

65
/
56

625
/
0
(

mg/m
L
)

Ferric

Reducing Antioxidant Power (FRAP) (Gallic acid equivalent)

5
/
0

±

55
/
7

mg
/g Gallic acid equivalent

Total phenolic content GAE (μg gallic acid/mg sample)

50
/
6

±

60
/
146

μg gallic acid/mg of oil

DPPH effect (%)

(

)

amount of essential oil

5

/

1

±

6



قیمت: تومان

دسته بندی : شیمی و مهندسی شیمی

دیدگاهتان را بنویسید