ارزيابي خواص فيزيكي داربست كامپوزيت نانوكريستال هيدروكسي آپاتيت/ پلي هيدروكسي بوتيرات براي كاربرد در مهندسي
بافت استخوان

محمدرضا فروغي1* ، سعيد كرباسي2 ، رضا ابراهيمي كهريزسنگي3 و عباس سعادت4
مربي، دانشگاه آزاد اسلامي، واحد نجف آباد، گروه مهندسي مواد، اصفهان، ايران
استاديار، گروه فيزيك و مهندسي پزشكي دانشگاه علوم پزشكي اصفهان، اصفهان، ايران
دانشيار، دانشگاه آزاد اسلامي، واحد نجف آباد، گروه مهندسي مواد، اصفهان، ايران
مربي، دانشگاه آزاد اسلامي، واحد مجلسي، گروه مهندسي مواد، اصفهان، ايران
*foroughi@iaun.ac.ir
(تاريخ دريافت: 03/02/1390، تاريخ پذيرش:30/05/1390)

چكيده
هيدروكسي آپاتيت به خاطر توانايي كه در بازسازي استخوان دارد در مهندسي بافت استخوان نقش مهمي را ايفا مـي كنـد . در ايـن تحقيـق ابتـداپودر نانوكريستال هيدروكسي آپاتيت (HAp) به روش تجزيه گرمايي از استخوان ران گـاو در دمـايC °900 تهيـه و سـپس داربسـت متخلخـلسراميكي هيدروكسي آپاتيت با درصدهاي وزني 40، 50 و 60 به روش تكرارپذيري اسفنج پلي يورتان سـاخته شـد . سـپس داربسـت هـا توسـط محلول پلي هيدروكسي بوتيرات (P3HB) در زمان هاي 30 ثانيه و 1 دقيقـه پوشـش دهـي شـدند. بـراي مطالعـات فـازي، ريخـت شناسـي و تعيـينگ روه ه اي ع املي ب ه ترتي ب از دس تگاه ه اي مشخص ه ي ابي TEM ،SEM ،XRD و FT-IR اس تفاده ش د؛ در نتيج ه ب ا توج ه ب ه وج ودهيدروكسي آپاتيت طبيعي با اندازه ذرات nm85، داربستي با درصد وزني 50 و درصد تخلخل حـدود 90% و انـدازه بـين 100 تـاμm 400 بدسـتآمد كه مي تواند در مهندسي بافت استخوان كاربرد داشته باشد.

واژه هاي كليدي:
داربست؛ هيدروكسي آپاتيت؛ نانوكريستال؛ مهندسي بافت؛ پلي هيدروكسي بوتيرات؛ كامپوزيت.

مقدمه
مهندسي بافت1 علم طراحي و توليد بافت هاي جديد براي تـرميماندام هاي آسيب ديده و جايگزيني قسمت هاي از دسـت رفتـه بـهعلت عوامل مختلف مي باشد [1]. در بين بافت هاي بدن، استخوان پتانسيل بالايي بـراي توليـد مجـدد دارد و از ايـن رو يـك نمونـهمناسب براي مهندسي بافت به شـمار مـيرود. در شكسـتگي هـا وعيوب بزرگ، روند درمان كه توسط بدن انجام ميشود، كارساز نبوده و پيوند استخوان لازم ميشود [2]. دانشمندان از سال ها قبل قادر به كشت سلول ها در خارج از بدن بودند، ولي فناوري رشـدشبكه هاي پيچيده و سه بعدي سلولي براي جايگزيني بافت آسيب ديده اخيراً توسعه يافته است. براي ساخت يك بافت به شيوه هـايمهندسي، نياز به طراحي يك داربست با ساختار فيزيكـي مناسـببا امكـان چسـبندگي سـلول هـا بـه آن، مهـاجرت سـلولي، تكثيـرسلولي و تمايز سلولي و در نهايت رشد و جايگزيني بافت جديـداست. داربست هاي مورد استفاده در مهندسي بافت استخوان بايـدداراي تخلخل بالا و خواص زيست فعالي و زيست تخريب پـذيريمناسب و در عين حال خـواص مكـانيكي خـوبي باشـند كـه ايـنداربست ها بصورت زمينه پليمري و سـراميكي مـي باشـند كـه هـرك دام داراي مزاي ا و مع ايبي هس تند ك ه ب ا توج ه ب ه اهمي تزيس ت فع الي در مهندس ي باف ت اس تخوان، بهت ر اس ت ك ه از
داربســت هــاي زمينــه ســراميكي اســتفاده شــود [3]. اســتفاده از هيدروكسي آپاتيت2 به عنوان يك ماده زيست فعال سراميك هـايفسفات كلسيم و بخاطر شباهت نزديك تركيـب شـيميايي آن بـهجزء معدني و اصلي تشكيل دهنده اسـتخوان طبيعـي و دنـدان، درسال هاي اخير در ساخت كاشتني هاي مورد استفاده در ارتوپـديي ا دندانپزش كي ك اربرد ف راوان پي دا ك رده اس ت [4]. يك ي از روش هاي سـاخت داربسـت3 بـا تخلخـل هـاي بـالا، روش تكـرارپليمر4 مي باشد كه مي توان از اسفنج پلي يورتان5 استفاده كرد [5- 7]. تخلخل باز در داربست هاي متخلخل مي تواند عامل مهمي در رشد بافت باشـد . بـر اسـاس مطالعـات قبلـي [8- 15]، معيارهـاي مناسب براي يك داربسـت، تخلخـل هـاي بـاز، مقاومـت فشـاريخوب و امكان مهاجرت سلول ها مي باشـد . داربسـت هـايي كـه ازروش تكرار پليمر يـا غوطـه وري اسـفنج در دوغـاب6 سـراميكيساخته مي شوند از تخلخل و يكنواختي مناسبي برخوردار هسـتندولي به دليل وجود تخلخل هاي زيـاد از اسـتحكام فشـاري پـاييني برخوردار هسـتند و در صـورت قـرار گـرفتن در محـل اسـتخوانآسيب ديده، احتمال اين وجود دارد كه قبل از تشكيل پيوند بـينباف ت و اس تخوان، داربس ت تخري ب ش ود [2]، ل ذا دانش مندان تصميم به تقويت اين داربست ها گرفتند. يكي از روش هـايي كـهبراي تقويت اين نوع داربست هـا مـورد اسـتفاده قـرار مـي گيـرد،روش پوشش دهي پليمر تقويـت كننـده بـر روي ايـن داربسـت هـا مـــيباشـــد. زيگنـــگ ميـــاو 7 و همكـــارانش پوشـــش پليمـــرپلي لاكتيك كوگلايكوليـك اسـيد8 (PLGA) بـر روي داربسـتسراميكي هيدروكسي آپاتيت- تري كلسيم فسفات اعمـال كردنـدكــه داربســت ســراميكي پوشــش داده شــده ريخــت شناســي و استحكام مناسبي را بدست آورد [16]. تان9 و همكارانش پوشش پليمــ ر PLGA-Bioglass را بــ ر روي داربســ ت ســ راميكيهيدروكس ـي آپاتيــت پوشــش دادنــد كــه داربســتي بــا خــواصزيست فعالي مناسبي را بدست آوردند [17].
يكي از تمهيدات صورت گرفته در اين پژوهش ايجاد تخلخـل در هيدروكسي آپاتيت سنتز شده مي باشد. رشد بافـت در داخـل تخلخلها، فصـل مشـتركي بـا سـطح تمـاس زيـاد ، بـين كاشـتني سراميكي و بافت ميزبان فراهم ميسازد [18]. ميزان تخلخـل هـا، توزيع اندازه تخلخل ها، ريخت شناسي، جهت گيري و ميـزان بـه هم پيوستگي تخلخـل هـا بـه شـدت بـر روي نفـوذ اسـتخوان در هيدروكسي آپاتيت متخلخل تأثير مي گذارد. لـذا در ايـن تحقيـقابتدا پودر نانوكريستال هيدروكسي آپاتيت از استخوان ران گاو10 به روش تجزيـه گرمـايي تهيـه و سـپس از روش تكـرار پليمـر يـاغوطــه وري اســفنج در دوغــاب ســراميكي، داربســت متخلخــلساخته شد و براي بهبود خواص مكانيكي به وسيله غوطه وري در پليمر پلي هيدروكسي بـوتيرات 11 (P3HB) پوشـش دهـي شـد. در نتيجه داربستي با ريخت شناسي كاملاً متخلخـل و بـه هـم پيوسـتهبدست آمد.

مواد و روش ها
پس از تهيه استخوان ران گاو، ابتدا آن را بـه مـدت 2 سـاعت درآب جوشانده تا گوشت و چربـي هـاي متصـل بـه آن جـدا شـود. سپس استخوان ها را به مدت 24 ساعت در دماي C°60 قرار داده تا رطوبت آن خشـك شـود. بـراي جلـوگيري از ايجـاد دوده درمواد هنگام گرم كردن، استخوان ها با اره بـه تكـه هـاي كـوچكي(ح دود mm10×10×10) ب رش داده ش دند و س پس در ه وا ب ه مدت 3 ساعت با مشعل تا دماي حدود C°400 سوزانده شدند تـاتركيب ات آل ي آن تجزي ه شـود . م اده حاص ل از اي ن فرآين د،خاكســتر ســياه رنــگ اســتخوان مــي باشــد كــه بــراي توليــدهيدروكسي آپاتيـت مـورد اسـتفاده قـرار مـي گيـرد . پـس از ايـنفرآيند براي توليد، پودر هيدروكسي آپاتيت در دماي C°900 بـهمدت 2 ساعت تحت عمليـات حرارتـي قـرار گرفـت [19]. مـادهحاصـ ل از ايـ ن مرحلـ ه، پـ ودر سـ فيد رنـ گ نانوكريسـ تالهيدروكسي آپاتيت مي باشد كه براي ساخت داربسـت سـراميكيمورد استفاده قرار گرفت.
يكي از مهم ترين مراحل ساخت داربست مختلخل، تهيه دوغـابپايدار با كمك افزودني هاي مناسب ميباشد. طبق تحقيقـاتي كـهدر مورد ساخت دوغاب مناسب صورت پذيرفت، افزودنـي هـايمتنوعي بـا اهـداف مختلـف و بـا توجـه بـه خـواص زيسـتي آنهـابررسي شد. در اين تحقيق، از پـودر طبيعـي هيدروكسـي آپاتيـتتهيه شده از روش تجزيه حرارتي با اندازه دانه حـدود 85 نـانومتربراي ماده زمينه داربست استفاده شد. پودر هيدروكسي آپاتيت بـادرصدهاي وزني 40، 50 و 60 درون آب مقطر دوبـار تقطيـر بـهآرامي حل شـد تـا از كلوخـه اي شـدن جلـوگيري شـود. پـس ازهمگن شدن محلول، به دليل نياز به اسـتحكام مكـانيكي مناسـب،بايد ميزان جامدي كـه بـر روي اسـفنج پليمـري مـينشـيند، زيـادباشد. بنابراين براي افزايش درصد وزني جامد از مقدار 1% وزني متفرق سـاز 12 آمونيـوم پلـي متـاكريلات (APMA) اسـتفاده شـد. سپس دوغاب با سرعت مناسب (300 دور در دقيقه) به مـدت 30 دقيقه همزده شد تا محلولي بصورت همگن بدسـت آيـد. مقـدار1% وزنــي از پــودر كربوســيمتيــل ســلولز (CMC) بــه عنــوانپيونددهنده13 و افزايش روانـروي دوغـاب بـه آرامـي بـه محلـولاضافه مي كنيم. سـپس محلـول تـا همگـن شـدن كامـل درC °60 همزده شد.
پس از تهيه دوغاب نوبت به ساخت داربست مي رسد كـه اسـفنجتجــاري پلــييورتــان (cpi80) پــس از بــرش بــه ابعــاد مناســب(3cm1×1×1)، به آرامي درون دوغاب فـرو بـرده مـي شـود . فـوماسفنجي بوسيله خاصيت موئينگي به دوغاب آغشـته مـي گـردد وسپس در درون دوغاب فشرده مي شود تـا هـواي محبـوس در آنخارج شده و اسفنج توسط دوغاب پر شـود . فشـرده شـدن و بـازشدن مجدد اسـفنج در دوغـاب موجـب مـيگـردد كـه قطعـه دراندازه و شكل واقعي خود حامل دوغاب شود. اين مرحله يكي از مراحل مؤثر در خواص نمونه ها است. در اين مرحله بايـد حـدود25-75% دوغاب توسط اعمال نيروي مكانيكي، از اسفنج حـذفشود. خاصيت ارتجاعي بالاي اسفنج در اين مرحله باعث مي شود اسفنج به شكل و ابعاد اوليه خود باز گردد. براي جلوگيري از پـرشدن تخلخل هـاي اسـفنج، نمونـه هـا بـه مـدت 24 سـاعت درونمحيط خلاء خشـك شـدند؛ سـپس نمونـه هـا در كـوره عمليـاتحرارتي (FinrTech, Muffle Furnace) قرار گرفتند و در چهار مرحله كه شامل، (1) قرار دادن نمونـه هـا داخـل كـوره در دمـايC°600 با نرخ سرعت گرم شدن C/min°3 به مـدت 1 سـاعتجهت سوختن كامل اسفنج پليمري، (2) افـزايش دمـا از 600 بـهC°1200 با نرخ سرعت گرم شدن C/min°5، (3) نگهـداري دردم اي C°1200 ب ه م دت 4 س اعت جه ت ت ف جوشـي ش دن داربست سراميكي و (4) سرد كردن در كوره تا دماي اتاق با نرخ ســــرعت ســــرد شــــدنC/min °5 مــــي باشــــد، داربســــتهيدروكسي آپاتيت تشكيل شد. پس از خارج كـردن نمونـه هـا ازكوره، نمونهها وزن شدند و سپس درون دسيكاتور قرار گرفتنـد . براي پوشش دهي داربست، مقدار 6/0 گرم پودر P3HB را در10 ميلي ليتر حلال كلروفرم (3CHCl) بـه مـدت 6 سـاعت در حمـامروغــن و دمــايC °60 حــل كــرده و محلــول پليمــري بــراي پوشش دهي داربست سراميكي بدست آمد. براي تهيه اين محلول بخاطر فرار بـودن كلروفـرم بايـد از دسـتگاه مبـرد اسـتفاده شـود. سپس داربست هيدروكسي آپاتيت را در زمـان هـاي 30 ثانيـه و 1 دقيقه در محلول پليمري غوطه ور كرده و بـراي يكنواخـت شـدنپوشش در همه نقاط داربست و خروج محلـول پليمـري اضـافي،نمونه ها درون سانتريفيوژ با سـرعت 500 دور در دقيقـه بـه مـدت30 ثانيه قرار گرفتند و نهايتاً نمونه ها به مـدت 24 سـاعت در آونخلاء قرار داده شدند تا خشك شوند.

2-1- مشخصه يابي نمونه ها
براي بررسي تغييـرات سـاختاري و مطالعـه فازهـا از روش پـراشپرتو ايكس (XRD, Philips X’Pert) استفاده شد. براي آناليز از تابش پرتو CuKα استفاده شـد . نـرخ روبـش معـادل 1 درجـه بـردقيق ه، ولت اژ اعمـالي براب ر 30 كيل و ول ت و جري ان مع ادل 30 ميلي آمپـر بـود و زاويـه پـراش (θ2) از 10 تـا 90 درجـه انتخـابگرديد. پس از حصول الگوي پراش پرتـو ايكـس، بـراي مطالعـهگـــ روه هـــ اي عـــ املي از طيـــ ف ســـ نج مـــ ادون قرمـــ ـز (FT-IR:6300,JASCO,Japan) براي شناسايي وجـود تركيبـاتآلي و همچنين درجه دي هيدروكسيلاسيون هيدروكسـي آپاتيـتدر طي عمليات حرارتي استفاده شد. تجزيه وزن سنجي گرمايي14 (TGA) براي اندازه گيري ثبـات حرارتـي و تركيـب مـواد مـورداستفاده قرار گرفت. اين اندازه گيـ ري، كـاهش درصـد وزن مـادهنسبت بـه تغييـرات دمـايي را نشـان مـي دهـد . در ايـن تحقيـق، ازدس تگاه تجزي ه وزن س نجي گرم ايي (TG/DTA,TGA 401, Sanatara.co) براي كاهش درصد وزن اسفنج پلي يورتان نسـبتبه دما استفاده شد. براي محاسبه تخلخل و دانسـيته داربسـت هـا ازروش جابجـ ـايي مـ ـايع15 (قـ ـانون ارشـ ـميدس) اسـ ـتفاده شـ ـد.
اندازه گيري دانسـيته اطلاعـاتي در مـورد انـدازه و توزيـع منافـذ،نفوذپذيري و حضور عيوب ساختاري در سـاختارهاي سـراميكيت فجوش ي شـده ارائ ه م ي ده د [20]. در اي ن روش ب ه دلي ل خاصيت آبگريز بودن پليمر، بجـاي آب، از اتـانول 96% اسـتفادهشد كه به راحتي درون تخلخل هاي ريز نفوذ نمايد.
دانسيته داربست (ρ) از رابطه (1) محاسبه مي شود [21]:
3ρ = W/V2-Vو مقدار تخلخل باز داربست (ε) از رابطه (2) بدست مي آيد:
ε = V1-V3/V2-V3
W= وزن داربست سراميكي
1V= حجم اتانول درون استوانه مدرج
2V= حجم اتانول پس از قرار گرفتن نمونه درون استوانه مدرج
3V= حجم اتانول باقيمانده پـس از خـارج كـردن نمونـه از درون استوانه مدرج
بـ راي مشخصـ ه يـ ابي پـ ودر هيدروكسـ ي آپاتيـ ت، نمونـ ه بـ ا ميكروســكوپ الكترونــي عبــوري (TEM, Philips CM10) تصويربرداري شد، به اين ترتيـب كـه نمونـه درون اتـانول مـرك100% گذاش ته ش د، س پس در پ راب مس تقيم دس تگاه SMC ب ه م دت 10 دقيق ه س ونيكيت شـد و ب ر روي گيري د هاي ب ا پاي ه Formvar با مش 200 قـرار گرفـت. در نهايـت نمونـه خشـك ووارد دس تگاه ق رار داده ش د. ميكروس كوپ الكترون ي روبش ي (SEM, Philips XL-30, Netherlands) نيز به منظـور مطالعـه وبررسي مشخصات ظاهري داربست مورد استفاده قرار گرفت.

نتايج و بحث
مشخصه يابي پراش اشعه ايكس شكل 1، طيف هاي XRD پودر هيدروكسي آپاتيـت تـف جوشـيشده در دماي C°900 و داربست متخلخل هيدروكسي آپاتيـت واستاندارد JCPDS:9-432 را نشان مي دهد. همانطور كه در شكل مشــاهده مــيشــود، طبــق اســتاندارد ، همــه قلــه هــا مربــوط بــههيدروكسي آپاتيت خالص مي باشد. پس مـي تـوان نتيجـه گرفـتكه داربست ساخته شده بدون هرگونه ناخالصي مي باشد. با توجه به شكل، پيك هاي اصـلي پـراش اشـعه ايكـس پـودر و داربسـتهيدروكسي آپاتيت در محدوده 30 تا 35 درجه قرار گرفته اسـتكه مطابقت كامل با استاندارد دارد. علت كشيده شدن پيك ها در داربست، بخاطر افزايش دماي تف جوشي به C°1200 مـي باشـد؛ ول ي در پ ودر هيدروكس يآپاتي ت بخـاطر كمت ر ب ودن دم ايتف جوشي، دانه ها فرصت رشد نداشته و لذا پيك هاي مربوط بـهپودر هيدروكسي آپاتيـت داراي پهـن شـدگي بيشـتري نسـبت بـهداربست متخلخل هيدروكسيآپاتيت ميباشد.

مشخصه يابي طيفسنج مادون قرمز به منظور بررسـي حضـور گـروه هـاي عـاملي موجـود در پليمـر ونانوكريســتال هــاي هيدروكســي آپاتيــت و همچنــين چگــونگياثربخشي اين گروه هـا بـه هنگـام تركيـب ايـن مـواد بـا يكـديگر،آزمون FT-IR بر روي پليمـر خـالص P3HB، نانوكريسـتال هـايهيدروكسي آپاتيت و نانوكريستال هـايHAp/P3HB انجـامپـذيراست. نتايج حاصل از اين آزمون در شكل 2 ارائه شده است.

شكل (1): پراش اشعه ايكس پودر هيدروكسيآپاتيت تف جوشي شده در
دماي C°900، داربست متخلخل هيدروكسي آپاتيت مطابق با استاندارد
JCPDS:9-432

طيف جذب مربوط به نانوكريستال هـاي هيدروكسـي آپاتيـت در شكل 2، پيـك هـاي مربـوط بـه فـاز آپاتيـت را بـه وضـوح نشـانمي دهد. پيك هـاي مشـاهده شـده در محـــ دوده 1-cm 616-560 مربوط به ارتعاش از نوع چرخشي پيوندهاي يـون 3-4PO و جـذبدر 1-cm 1020 ناشي از ارتعــاش از نوع كشـشـي پيوندهاي يـون3-4PO مي باشـد. گـروه -OH هيـدروكســي آپاتيـت يـك پيــكپــهن در طيـف 1-cm 3577 را نشـان م يده د و همـانطور ك ه همانطور كه مشخص است سنتز هيدروكسـي آپاتيـت معمـولاً درمحيط آبي صورت ميگيرد و به دليل وجود فازهـاي آمـورف درسـاختار پ ودر هيدروكس ي آپاتي ت، امك ان وارد ش دن آب ب هس اختار هيدروكس يآپاتي ت وج ود دارد. ب ه ع لاوه منش اء آب جذب شده مي تواند از محيط اطـراف و يـا دسـتگاه طيـف سـنجFTIR نيز باشد. لذا همواره در طيف هاي FTIR پيك هاي مربوط به آب جذب شده نيز مشاهده مي شـوند. در شـكل 2 پيـك پهـنظ اهر ش ده در ناحي ه تقريب ي 1-cm 1126 مرب وط ب ه حرك اتخمشي گروه هيدروكسيل آب جذب شده است [22]. در نمودار P3HB، پيك هاي 1-cm 1051 و 1-cm 1126 و 1-cm 1172 ناشي از پيوند C-O موجود در P3HB است كه پيك هـاي 1-cm 1126 و 1172 به ترتيب مربوط به ارتعـاش كششـي نامتقـارن و متقـارنپيوندC-O است. گـروه هاي 3CH پيك تيـزي را در 1-cm 1374 به وجود مي آورند كه ناشي از ارتعاش كششي ايـن پيونـد اسـت.
-185881-511359

در عدد موجي 1-cm 1720 يك پيك بسيار تيز و واضح مشـاهدهمي شود كه ناشي از ارتعاش كششي گروه هاي كربونيل مي باشـد. همانطور كه ملاحظه مي شود در شكل 2- ج در عدد مـوج 1-cm 1717 يك پيك كوتاه از گروه كربونيل تشكيل شـده اسـت كـهمربوط گروه كربونيل طيف P3HB مي باشد.

P3HB FT-IR شكل (2): طيف جذب ، الف) پليمر ، ب) داربست هيدروكسي آپاتيت و ج) داربست HAp/P3HB

P3HB داراي گ ـروه ه ـاي انته ـايي هيدروكس يل م ـي باش ـد ك ه مي توان پيك پهن مربوط به ايـن گــروه را در مح ـــــدوده 1-cm
3680-3100 مشاهده نمود.
به منظور بررسي دقيق تر برهم كنش ذرات HAp و P3HB، طيـفFT-IR اين كامپوزيت در مقايسه با ذرات HAp در دو محـدودهجــذب 1-cm 650-550 و طيــف FT-IR كـامپوزيـت بـا پــليمرخالـــص در محدوده جــذب 1-cm 1740-1717 در شـكل 3 بـاوضوح بيشتر نشان داده شده اسـت . چنانچـه مشـهود اسـت پيـكجذب گروه كربونيل P3HB خالص در فركـانس 1-cm 1724 بـه صورت تيزتر و واضح تر نسبت به پيك مربوط در نانوكامپوزيـتآشـــــكار مــــ ي گــــ ردد. در ضــــ من ايــــ ن پيــــ ك در نانوكامپوزيت HAp/P3HB به عدد موجي پـايين تـر 1-cm 1721 انتقال يافته است. انتقال پيك جـذب كربونيـل بـه فركـانس هـايپ ايينت ر احتم ال وق وع پيون دهاي هي دروژني ب ين گ روه ه اي كربونيل موجود در P3HB و گـروههـاي مسـتعد در ذراتHAp را نشان مي دهد [23]. اين پديـده مـي توانـد مقياسـي بـراي تأييـدتوزيع ذرات HAp در بستر پليمر بـه صـورت يكنواخـت و كـاراباشد. مقايسه پيك هاي مربوط به -43PO در هر دو حالت ارتعاش كشش ي و چرخش ي، نش انگر ك اهش ش دت اي ن پي ك ه ا در نانوكامپوزيت نسبت به HAp خالص است.

(ب ،HAp/P3HB و HAp (براي، الف FT-IR شكل (3): مقايسه نمودار HAp/P3HB و P3HB
همچـنيـن عــدد موجـ ـي ايــن پيــك هـا بــراي چـرخشـــ ي بـ ـه ترتيـــب از 1-cm 574، 598 و 628 در HAp خالـــص بـــه 1-cm 566، 604 و 633 در نانوكامپوزيت كـاهش يافتـه اســت (شـكل
3). در مورد پيـكهاي كشـشي-43PO عدد موجي از 1-cm 1025 در HAp خـــالص بـــه وضـــوح در عـــدد مـــوجي 1-cm 1019 نانوكامپوزيت ديده مي شود كه اين وضوح پيك بـه دليـل زمينـهســراميكي داربســت اســت. ايــن شــواهد حضــورHAp را در كامپوزيت اثبات مي كند و چنانچه گفته شد تغييـر اعـداد جـذبپيوندها به اعداد موجي پايين تر احتمـال ايجـاد پيونـد هيـدروژنيمي ان گ روهه اي هيدروكس يل و-43PO هيدروكس ي آپاتي ت و گروه هاي كربونيل P3HB را نشان ميدهد.
3-3- مشخصهيابي SEM و TEM هيدروكسيآپاتيت شـ كل 4 تصـ اوير ميكروسـ كوپ الكترونـ ي عبـ وري (TEM) و ميكروس كوپ الكترون ي روبش ي (FE-SEM) پ ودر نانوكريسـتال هيدروكسي آپاتيت را نشـان مـي دهـد . بـا توجـه بـه شـكل ملاحظـهمي شود كه ذرات عمـدتاً مورفولـوژي شـبه كـروي داشـته و انـدازهذرات ح دود nm85 م يباش د. از آنجاييك ه هيدروكس يآپاتي ت نانوكريستالي با مورفولوژي كـروي در مقايسـه بـا مورفولـوژي هـاينامنظم در فرايند استخوانسازي از اهميت بيشتري برخوردار است.

3-1- تجزيه وزن سنجي گرمايي اسفنج پلييورتان به منظور اطمينان از محدوده دمايي تجزيه اسفنج پلـي يورتـان، ازدستگاه TGA استفاده شد. بطور كلي، تجزيه حرارتي پليمر نقش حياتي در سنتز سراميك ها با استفاده از مواد پليمري ايفا مـي كنـد[24]. به منظور جلوگيري از ايجـاد تـرك در سـاختار سـراميك،بايد زمان كافي براي سوختن اسفنج پليمري وجـود داشـته باشـد.
در اين تحقيق، تجزيه حرارتي انجام شده، دمـاي سـوختن كامـلاسفنج پليمري را مشخص مي نمايد. شكل 5 تغييرات وزن اسـفنجپلي يورتان را بر اساس درجه حرارت نشان مي دهد. همانطور كـهمشاهده مـي شـود تجزيـه اسـفنج پليمـري در دو مرحلـه صـورتمي گيرد. مرحلـه اول از حـدودC °230 شـروع شـده و تـا دمـايC°420 ادامه مي يابد. به دليل توليد ميزان گاز در اثر اكسيد شـدن پليمـر، كـاهش وزنزيادي در اين مرحله مشاهده مي شود. امـا ميـزان كـاهش وزن درمرحله دوم تجزيه، محـدوده دمـايي 420- C°600، چنـدان قابـلتوجه نيست. بخش عمده پليمـر در دمـاي بـين 230 تـاC °600 از سيستم خارج مي شود، از اين رو در نظر گرفتن سرعت گرمـايشآهسته در اين مرحله براي جلـوگيري از تخريـب سـاختار در اثـرخروج گازهاي ناشـي از تجزيـه حرارتـي پليمـر امـري ضـرورياست. در دماهـاي بـالاتر ازC °600 پليمـر اسـفنجي كـاهش وزنكمي دارد كه آن را مي توان بـه اكسـيد شـدن مقـداري از كـربنحاصل از فرآيند تجزيه پليمـر دانسـت. سـوختن و حـذف كامـلاسفنج پليمري در دماي C°600 اتفاق مي افتد.
60% وزني HAp 50% وزني HAp 40% وزني HAp نمونه
ε
(%) ρ
(gr/cm3) ε
(%) ρ
(gr/cm3) ε
(%) ρ
(gr/cm3) 82 2/24 87 2 89 1/72 1
76 2/65 80 2/33 84 2/10 2
69 2/80 77 2/48 81 2/31 3
32169758046

سپس براي سوختن كامل اسـفنج، بـه مـدت 1 سـاعت در دمـايمذكور نگه داشته شد.
3-2- تخلخل و دانسيته داربست هيدروكسيآپاتيت با و بدون پوشش P3HB
در جدول 1 ميانگين درصد تخلخل ها و دانسيته داربست بـدون وبا پوشش P3HB آورده شـده اسـت كـه همـانطور كـه مشـخصاست با اعمال پوشش پليمري روي داربست از درصد تخلخل هـاكاسته شده است. داربست ها پس از پوشـش دهـيP3HB حـدود12% افزايش وزن پيـدا كردنـد. در جـدول 1، نمونـه 1، داربسـتسراميكي بدون پوشش پليمري، نمونـه 2، داربسـت سـراميكي بـا پوشش پليمري و زمـان غوطـه وري 30 ثانيـه ، نمونـه 3، داربسـتس راميكي ب ا پوش ش پليم ري و زم ان غوط ه وري 1 دقيق ه و ε درصد تخلخل و ρ دانسيته مي باشد.

جدول (1): درصد تخلخل و دانسيته داربست 40، 50 و 60% وزني هيدروكسي آپاتيت بدون و با پوشش پليمري P3HB
شكل (4): الف) تصوير ميكروسكوب الكتروني عبوري و ب) تصوير ميكروسكوب الكتروني روبشي نانوبلور هاي هيدروكسي آپاتيت
297465989363

3-3- ريخـــتشناســـي ســـاختار متخلخـــل داربســـت
هيدروكسي آپاتيت با و بدون پوشش P3HB
بمنظور بررسي مشخصات ظاهري و ريخت شناسي داربست بـا وب دون پوش ش P3HB، مطالع ات ريزس اختاري ب ا SEM انجـام گرفت (شكل 6).
داربست سـراميكي هيدروكسـي آپاتيـت در ايـن تحقيـق از روشتكرارپذيري اسفنج پلي يورتان ساخته شد كه محصول نهـايي آنداربستي با درصد تخلخل بالا مـي باشـد . شـكل 6- الـف تصـوير
شكل (5): كاهش وزن در اثر تجزيه حرارتي اسفنج پلييورتان محـ دوده ميكروسكوپ 300 تـ ا μmالكتروني 700 رااسفنج قبـپلي ل از يورتان با غوطـ ه وريتخلخـل در هـاي دوغـبـاز ابدر
1712617284

نرخ بنابراين، گرم براي شدن C/min°جلوگيري3 از بالا شوكرفت تـا بـه حرارتي و دمـايC ايجاد° 600 ترك، دما رسـيد وبـاسراميكي ســراميكي كه نشــان محدودهمــي قطر دهــد و تخلخل ها شــكل 6بين- ب 100 تا μmداربســت 400 است رامتخلخــل نشان ميدهد كـه بـراي يكنـواختي تخلخـلهـا و مشـخص بـودنفصل مشترك بين زمينه و پوشش، داربست قبل از تصويريرداري توسط دستگاه پـوليش الماسـي، سـايش داده شـد. ايـن محـدودهنزديك به قطر تخلخل هاي استخوان مي باشـد و همـانطور كـه درش كل 6- ج ديـده م ي ش ود، محل ول پليم ر ي P3HB پ س از غوطه وري داربست سـراميكي بصـورت پوششـي بـر روي ذراتهيدروكس ي آپاتي ت نشس ته اس ت ك ه باع ث اف زايش اس تحكام
داربست مي شود ولي همانطور كه در شكل مشخص است پس از
پوشش دهي اندازه تخلخل ها كمتر شـده اسـت كـه قطـر آنهـا درحدود 100 تا μm 250 مـي باشـد . شـكل 6- د پوشـش همگـن ويكدست P3HB را بر روي داربست سراميكي نشان داده است.

4- نتيجه گيري
در اين تحقيق داربست سـراميكي بـا 40، 50 و 60 درصـد وزنـي
هيدروكسي آپاتيت بـا اسـتفاده از اسـفنج پلـي يورتـان بـا تخلخـل
نزديك استخوان طبيعي ساخته شد و سپس بدليل شـكننده بـودنداربست، بوسيله محلول پليمري P3HB در زمان هـاي 3 و ثانيـه و1 دقيقه پوششدهي شدند. نتايج اين تحقيق:
– پودر نانوكريسـتال هيدروكسـيآپاتيـت بـا انـدازه دانـههـايحدود nm85 به عنوان ماده زمينه اين داربست پس از تف جـوش
شدن در دماي C°900، بدون هيچگونه ناخالصـي مـورد اسـتفاده
قرار گرفت.
– ب ا نت ايج حاص ل از آزم ون FT-IR مش خص گردي د ك ه كاهش شـدت پيـك گـروه هـاي كربونيـل و انتقـال آن بـه عـدد موجي در داربست نانوكامپوزيتي، همچنين كاهش شـدت پيـك جذبي و انتقال به فركانس هاي پايين تـر در داربسـت HAp/PHB مرب وط ب ه -43PO، احتم ال پيون د هي دروژني مي ان گ روه ه اي
كربوني ــــــل PHB و -43PO و -OH هيدروكسـي آپاتيـت وجـودشكل (6): الف) تصوير SEM اسفنج پلي يورتان، ب) سطح مقطع د اربست
دارد. هيدروكسي آپاتيت بدون پوشش، ج) سطح مقطع داربست هيدروكسي آپاتيت با پوشش P3HB و د) داربست با پوشش P3HB در بزرگنمايي x500

– نتايج حاصل آزمون درصد تخلخل ها نشـان داد كـه بهتـريندرصـد وزنـي بـراي توليـد داربسـت، مقـدار 50 درص د وزن ي هيدروكسي آپاتيت مي باشد.
– به طور كلي بدون در نظر گرفتن خواص فيزيكي و با توجـهبه نتايج حاصل از تصاوير SEM، بهترين داربست براي كشـت ورشد مناسب تر سلول هاي بافت استخوان، نمونه ي تهيه شده بـا 50 درصد وزني هيدروكسي آپاتيت مي باشد. 5 – ساخت داربست مناسـب بـراي اسـتفاده در مهندسـي بافـت،مســتلزم آزمايشــات زيســت فعــالي، زيســت تخريــب پــذيري،تست هاي مكانيكي و كشت سلولي مي باشد كـه بـراي تحقيقـاتآتي پيشنهاد مي شود.

سپاسگذاري
در اينجا لازم است از جناب آقاي پروفسور حمدي عضـو هيئـتعلمي دانشگاه UM مالزي و جناب آقاي دكتر ربيعي عضو هيئت علم ي دانش گاه نوش يرواني باب ل ك ه م را در انج ام اي ن تحقي ق راهنمايي كردند، كمال تشكر را داشته باشم.

منابع

R. Lanza, R. Langer, J. Vacanti, “Principle of Tissue Engineering”, Academic Press, Third Edition, p. 6, 2007.
O. Jeffrey, A. Thomas. Einhorn, A. Bruce Doll, S.Charles, “Bone Tissue Engineering”, CRC Press, pp. 54, 2005.
Wojciech, Suchanek, Yoshimura, Masahiro, “Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants”, Journal of Materials Research, Vol. 13, Issue 1, pp. 94-117, 1998.
L. Hench, “Bioceramics: From Concept to Clinic”, Journal of the American Ceramic Society, Vol. 74 (7), pp. 1487- 1510, 1991.
A.C. Queiroz, S. Teixeira, J.D. Santos, F.J. Monteiro, “Production of porous hydroxyapatite with potential for controlled drug delivery”, Advanced Materials Forum, Vol. 455–456, pp. 358–360, 2004.
A.C.Queiroz, S. Teixeira, J.D. Santos, F.J.Monteiro, “Laser surface modification of hydroxyapatite and glassreinforced hydroxyapatite”, Bioceramics, Vol. 24, pp. 4607–4614, 2004.
S. Teixeira, M.P. Ferraz, F.J. Monteiro, “Biocompatibility of highly macroporous ceramic scaffolds: cell adhesion and morphology studies”, Journal of Materials ScienceMaterials in Medicine, Vol. 19 (2), pp. 855-859, 2008.
R. Zhang, PX. Ma, “Poly (a-hydroxyl acids)/hydroxyapatite porous composites for bone-tissue engineering – (1) Preparation and morphology”, J Biomed Mater Res, Vol. 44(4), pp. 446–455, 1999.
X. Huang, X. Miao, “Novel porous hydroxyapatite prepared by combining H2O2 foaming with PU sponge and modified with PLGA and bioactive glass”, J Biomater Appl, Vol. 21(4), pp. 351–374, 2007.
HW. Kim, JC. Knowles, HE. Kim, “Development of hydroxyapatite bone scaffold for controlled drug release via poly (e-caprolactone) and hydroxyapatite hybrid coatings”, J Biomed Mater Res-B, Vol. 70(2), pp. 240– 249, 2004.
AJW. Johnson, JR. Woodard, AJ. Hilldore, SK. Lan, CJ. Park, Morgan AW, et al. “The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity”, Biomaterials, Vol. 28(1), pp. 45–54, 2007.
X. Miao, LP. Tan, LS. Tan, X. Huang, “Porous calcium phosphate ceramics modified with PLGA-bioactive glass”, Mater Sci Eng C, Vol. 27(2), pp. 274–279, 2007.
JM. Oliveira, MT. Rodrigues, SS. Silva, PB. Malafaya,
ME. Gomes, CA. Viegas, et al. “Novel hydroxyapatite/chitosan bilayered scaffold for osteochondral tissue-engineering applications: scaffold design and its performance when seeded with goat bone marrow stromal cells”, Biomaterials, Vol. 27(36), pp. 6123–6137, 2006.
RC. Thomson, MJ. Yaszemski, JM. Powers, AG. Mikos, “Hydroxyapatite fiber reinforced poly (alpha-hydroxy ester) foams for bone regeneration”, Biomaterials, Vol. 19, pp. 1935–1943, 1998.
AR. Boccaccini, JJ. Blaker, V. Maquet, RM. Day, R.
Je´roˆme, “Preparation and characterisation of poly (latideco-glycolide) (PLGA) and PLGA/bioglass composite tubular foam scaffolds for tissue engineering applications”, Mater Sci Eng C, Vol. 25, pp. 23–31, 2005.
X. Miao, et al., “Mechanical and biological properties of hydroxyapatite/tricalcium phosphate scaffolds coated with poly (lactic-co-glycolic acid)”, Acta Biomaterialia, Vol. 4(3), pp. 638-645, 2008.
D.M.F. Tan, X. Miao, J. Li, Y. Xiao, R.Crawford, “Characterisation of Calcium Phosphate Cement-Derived Hydroxyapatite Scaffolds with a PLGA-Bioactive Glass Composite Coating”, Journal of Biomemetics, Biomaterials and Tissue Engineeringو Vol. 1, pp. 99-107, 2008.
S. Pramanik, AK. Agarwal, KN. Rai, “Development of high strength hydroxyapatite for hard tissue replacement”, Trends. Biomater Artif Organs, Vol. 19(1), pp. 46–51, 2005.
C.Y. Ooi, M. Hamdi, S. Ramesh, “Properties of hydroxyapatite produced by annealing of bovine bone”, Ceramics International, Vol. 33, pp. 1171–1177, 2007.
R. Hodgskinson, JD. Currey, “Effect of variation in structure on Young’s modulus of cancellous bone, a comparison of human and non-human material”, Proc Inst Mech Eng, Part H: J. Eng. Med., Vol. 204, pp. 115–121, 1986.
H. Ramay, M. Zhang, “Preparation of porous hydroxyapatite scaffolds by combination of the gel-casting and polymer sponge methods”, Biomaterials, Vol. 24, pp. 3293– 3302, 2003.
S. Koutsopoulos, “Synthesis and characterization of Hydroxyapatite crystals: A review study on the analytical methods”, J. Biomed. Mater. Res., Vol. 62, pp. 600-612, 2002.
R. Murugan, S. Ramakrishna, K. Panduranga Rao, et al. “Nanoporous hydroxy-carbonate apatite scaffold made of natural bone” Materials Letters, Vol. 60 (23), pp. 28442847, 2006.
K. Zin-Kook, O. Jeong-Jung, K. Hisamichi, “Achitecture of Porous Hydroxyapatite Scaffolds Using Polymer Foam Process”, Journal of Biomechanical Science and Engineering, Vol. 4(3), pp. 377-383, 2009.

واژه نامه
Tissue Engneering
Hydroxyapatite (HAp)
Scaffold
Polymer replication method
Polyurethane sponge
Slurry
Xigeng Miao
Poly(lactic-co-glycolic acid)
D.M.F. Tan
-01 Bovine bone
-11 Polyhydroxybutyrate (P3HB)
-21 Dispersant
-31 Binder
-41 Thermal Gravity Analysis (TGA)



قیمت: تومان


پاسخ دهید