تهيه و ارزيابي ساختاري داربست نانوكامپوزيتيPHB/nHA مورد استفاده
در مهندسي بافت استخوان

عباس سعادت 1* ، علي اصغر بهنام قادر2 ، سعيدكرباسي3 ، محسن رادمهر4 ، مرتضي صادقي4، محمد رضا فروغي5
دانشگاه آزاد اسلامي، واحد علوم وتحقيقات، گروه مهندسي پزشكي، تهران، ايران
گروه بيومواد، پژوهشكده نانوفناوري ومواد پيشرفته،تهران، ايران پژوهشگاه مواد وانرژي، تهران، صندوق پستي 4777-141555، ايران
دانشگاه علوم پزشكي اصفهان، دانشكده پزشكي، گروه فيزيك و مهندسي پزشكي، اصفهان، ايران
دانشگاه صنعتي اصفهان، دانشكده مهندسي شيمي، اصفهان، ايران
دانشگاه آزاداسلامي، واحد نجف آباد، گروه مهندسي مواد، اصفهان ايران
(تاريخ دريافت: 15/04/1390، تاريخ پذيرش:13/07/1390)
*a.saadat@srbiau.ac.ir
چكيده
در اين مطالعه ابتدا نانوذرات هيدروكسي آپاتيت (nHA) به روش سل – ژل سنتز و سپس داربست نانوكامپوزيتي پلـي 3-هيدروكسـي بـوتيرات/ هيدروكسي آپاتيت (PHB/nHA) به روش ريخته گري حلال و انحلال ذره تهيه شـد . تهيـه داربسـت هـا، بـا حـل كـردن PHB 8/0-4/0 گـرمدرcc10 كلروفرم انجام شد. مقدار ذرات nHA،10-0 درصد وزني نسبت به پليمر و نسبت PHB:NaCl، 30:70 ، 20:80 و10:90 انتخاب گرديد. به منظور تعيين ساختار پودر HA سنتز شده وهمچنين ساختار داربست ها، تكنيك هـاي پـراش پرتـو ايكـس (XRD)، آنـاليز پـراش پرتـو ايكـسبراساس طول موج ((EDS، طيف زيرقرمز تبديل فوريه (FTIR)، ميكروسكوپ الكتروني روبشي (SEM) و ميكروسكوپ الكتروني عبور نـوري(TEM) مورد استفاده واقع شد. اندازه ذراتHA طبق تصوير TEM، ،30 تا 40 نانومتروطبق رابطه دباي شرر 35 نـانومتر بـود. طيـف پـراش پرتـوايكس پودر هيدروكسي آپاتيت سنتز شده، تشكيل فاز آپاتيت را تاييد مـي كنـد . طيـف زيرقرمـز داربسـت هـاي كـامپوزيتي ايجـاد بـرهم كـنش شيميايي بين نانوذرات هيدروكسي آپاتيت وبستر پليمري را نشان ميدهد. كه حاصل اين برهم كـنش افـزايش اسـتحكام داربسـت خواهـد بـود.
تصاوير ميكروسكوپ الكتروني روبشي نشان مي دهد كه مورفولوژي ،اندازه و توزيع حفرات در داربست هاي تهيه شده يكنواخت بوده و انـدازهحفرات در محدوده μm 250- 200 است. ساختار داربست تهيه شده از محلول 4درصد وزنـي، يكنواخـت تراسـت. تعـداد حفـرات بازدرسـطحداربست، با افزايش مقدار نمك، بيشتر مي شود. مقدارتئوري درصد حجمي تخلخل داربست هاي تهيه شـده 84-57 بـراي 90-70 درصـد وزنـينمك محاسبه شد كه به مقادير به دست آمده به روش نفوذ حلال بسيار نزديك است. آزمون آنـاليز اشـعه ايكـس برحسـب طـول مـوج(EDS) نشان داد كه نانوذرات هيدروكسي آپاتيت به طور يكنواخت در ساختارداربست توزيع شده اسـت . ايـن مطالعـه نشـان مـي دهـد كـه كامپوزيـت(PHB/nHA) كانديداي خوبي در مهندسي بافت استخوان مي باشد.

واژه هاي كليدي:
داربست، مهندسي بافت، پلي هيدروكسي بوتيرات، هيدروكسي آپاتيت، نانوكامپوزيت

-1473196492

12 فرآيندهايمهندسياول

1- مقدمه
هدف مهندسي بافت جايگزيني بافت معيـوب يـا آسـيب ديـده بـاجايگزين هاي بيولوژيكي است كه بتواند عملكرد طبيعي بافـت رابه آن بازگرداند و يا حفـظ كنـد. پيشـرفت هـاي عمـده درحـوزهج ايگزيني عض و وهمچن ين پيش رفت در عل م مهندس ي م واد ب ه توسعه دنباله دارعلم مهندسي بافت كمك مي كند [1].
طي چند دهه گذشته، هدف اصلي مهندسي بافت برطـرف كـردنمحدوديت هاي متداول درمان براساس جايگزين كردن ارگـان هـاوكاشت بيومتريالها مي باشد[2-3] . داربست هاي متخلخل نقـشحياتي در سنتز مـاتريس بـين سـلولي و مولكـول هـاي بيولـوژيكيمربوطه جهت تسهيل تشكيل ارگان دارد[4‐5]. ويژگي هاي يـكداربس ت درمهندســي باف ت اســتخوان، ش امل ساختارداربســت، خواص سطحي، خـواص مكـانيكي و تخريـب پـذيري مـي باشـد .
خواص سطحي شامل قابليت چسبيدن، تمايز و تكثير سلول اسـت .
به علاوه داشتن يك ساختار بسيار متخلخل همـراه بـا يـك شـبكهحفرات به هم پيوسته براي مهاجرت سلول ها و انتقال مواد غـذاييو دفع متابوليكي، مورد نيازاست[5 ‐6].
ماتريس هايي كه به عنوان داربست استفاده مي شود، براي برطـرفكردن نيازهاي كشت سلول بايد خصوصيات زير را دارا باشد. اين داربست ها بايد طوري طراحي شوند كه اجازه نفوذ مواد غذايي به سمت سـلول هـاي كاشـته شـده را بدهنـد و همچنـين سـلول هـا را سازمان دهي نماينـد و چسـبيدن و مهـاجرت سـلول هـا را موجـبشوند. در ايـن رابطـه انـدازه حفـرات بسـيار مهـم هسـتند.خـواص مكانيكي داربست بايد متناسب بـا خواص مكـانيكي بافـت باشـد و اين خواص در حين ترميم بافت باقي بماند[٧].
روش هـاي مت داول س اخت داربس ت هـاي مهندس ي باف ت ش امل ريخته گري حلال-انحلال ذره، جدايش فازي، فوم سازي با گـازو فريزدراي، قالب گيري فشاري و غيره مي باشد[8]. مزيت روش ريخته گري حلال-انحلال ذره، كنتـرل درصـد تخلخـل و مسـتقلبــودن انــدازه و شــكل حفــرات از درصــد تخلخــل مــي باشــد.
محدوديت اين روش، ارتباط داخلي كـم بـين حفـرات نسـبت بـهديگـر روش ه ا مـي باش د ك ه بـا تركي ب آن بـا روش ه اي ديگ ر مي توان آن را بهبود بخشيد[8 – 9].
استخوان طبيعي مثالي از نانوكامپوزيت است كه مركب از دو فـازعمـده آل ي و معـدني در مقي اس ن انو مـيباش د [2]. وبس تر1 و همك ارانش نش ان دادن د ك ه ن انو هيدروكس ي آپاتي ت از طري ق افزايش چسبيدن استئوبلاست ها به داربست، چسبيدن استئوبلاست ها به يكديگر و مـواد معـدني حـاوي كلسـيم روي سـطح داربسـت، تشكيل بافت اسـتخواني جديـد را افـزايش مـي دهنـد[10]. گـروهتحقيق اتي م ا2 و همك ارانش داربس تي ك امپوزيتي را از پليم ر و ذرات ميكروني هيدروكسي آپاتيت تهيه كردنـد [10-12]. آن هـاهمچنـين انـدازه هيدروكسـي آپاتيـت را در اسـتخوان طبيعـي كـهمقي اس ن انو داش ت ش بيه س ازي كردن د و نش ان دادندك ه وقت ي داربست تخلخل بالا داشته باشد، افزودن نانو هيدروكسي آپاتيت، خواص مكانيكي و جذب پروتئين آن ها را بهبود ميبخشد[13].
هيدروكس ي آپاتي ت و ت ري كلس يم فس فات گ روه عم ده اي از بيومتريال ها در ترميم استخوان هستند[14-15]. اين مواد بـه دليـلش باهت س اختاري و ش يميايي ب ا ف از مع دني اس تخوان طبيع ي، خواص اسـتخوان سـازي و زيسـت سـازگاري مناسـب دارنـد . بـهعلاوه برهم كنش سلول هاي استخواني بـا آن هـا منجـر بـه قابليـتاتصال خوب به استخوان و توليد مجدد استخوان مي شود[16]. اما كاربردهاي كلينيكـي ايـن تركيبـات بـه دليـل شـكنندگي ذاتـي و قابليــت شــكل دهــي ضــعيف آن هــا محــدود مــي شــود[17].
داربست هـاي كـامپوزيتي پليمـر–سـراميك بـراي تركيـب كـردنخاصيت استخوان سازي كلسيم فسفات ها و قابليت شـكل پـذيريخوب پلي استرها، در مهندسي بافت استخوان توسعه يافتهاند. ايـنكامپوزي ت ه ا زيس ت فع الي وش كل پ ذيري خ وب دارن د. اي ن كامپوزيت ها همچنين قابليت كنترل ماكروسـاختار و ريـز سـاختاردرحين شكل دادن آن ها به منظـور انطبـاق بـا عيـوب اسـتخوان رادارا مي باشند[18-19]. ايـن نـانو كامپوزيـت هـا نـه تنهـا بـه دليـلشباهت تركيب شيميايي و ساختاري بـا اسـتخوان طبيعـي بلكـه بـهدليل عملكرد منحصر بـه فردشـان ماننـد دارابـودن سـطح بيشـتر واستحكام مكانيكي بهتر نسبت به پليمـر و هيدروكسـي آپاتيـت بـهتنهــايي، بــه عنــوان داربســت مهندســ ي بافــت اســتخوان توســعهيافته اند[20].
پل ي هيدروكس ي آلكانوئ اته ا (PHAs)3 خ انواده اي از پليمره ا هستند كه محدودهاي از مواد زيستي مناسـب بـراي مهندسـي بافـتاستخوان را توسعه مـيدهنـد [21]. پلـي هيدروكسـي آلكانوئـات هـا پلياسترهاي ترموپلاستيك زيست تخريب پـذير و زيسـت سـازگارهستند كه توسط برخي ميكروارگان يزمها توليد مي شوند [22 -23].
مطالعات زيادي با اسـتفاده از پلـيهيدروكسـي بـوتيرات(PHB)4 و كوپليمرهيدروكسي بوتيرات با والرات (PHBV)5 به عنـوان مـوادزيستي براي مطالعات در شرايط مشابه بـدن و شـرايط بـدن مـورداس تفاده ق رار گرفت ه اس ت[24]. مطالع ات زي ادي روي زيس ت س ازگاري پل ي هيدروكس ي ب ـوتيرات و كوپليمرهيدروكس ي بــوتيرات بــا والــرات توســط محققــ ين صــورت گرفتــه اســت.
در خصوص پلي هيدروكسي بـوتيرات مشـخص شـده كـه سـميتكم ي دارد ك ه عل ت اي ن مس ئله تب ديل آن ب ه 3-هيدروكس ي بوتيرات است، كه يك جزء طبيعي خـون انسـان اسـت[25]. پلـي هيدروكس ي ب وتيرات در ميكروارگ اني زمه ا همانن د ي ك ان رژي داخلي سلولي و ذخيره كننده كربن عمل مي كند. خواص مختلف ماننــد طبيعــي بــودن، زيســت تخريــب پــذيري[26] و زيســت سـ ازگاري[27-28] ايـ ن پليمـ ر را بـ راي بسـ ياري از مصـ ارف كاربردي در بدن انسان مناسب مي سازد[29].
هيدروكسي آپاتيت سنتزي و طبيعي، تركيب شـيميايي و خـواصكريس تالوگرافي مش ابه اس تخوان طبيع ي انس ان دارد [30 – 31].
زيست سازگاري و قابليت تحريك به اسـتخوان سـازي ايـن مـاده براي كاشتني هاي استخوان مناسب است [32]. مطالعات نشان داده است كه افزودن هيدروكسـ ي آپاتيـت بـه مـواد زيسـتي، عملكـردمكانيكي و پاسخ سلولي در برابر سلول هاي استئو بلاست را بهبـود مي بخشد[33 – 34]. بـراي اولـين بـار ، در ايـن مطالعـه نـانو ذرات هيدروكسي آپاتيت با پلي هيدروكسـي بـوتيرات مخلـوط شـده و تاثير اين اختلاط بر ساختار و مورفولوژي داربسـت مـورد مطالعـهقرار ميگيرد.

2- مواد و روشها
2-1- مواد
كلسيم نيترات تتراهيدرات، تري اتيل فسفيت، سديم كلريد و اتانول شركتMerck مورد استفاده قرار گرفت. اندازه بلورهاي نمك سديم كلريد مورد استفاده در محدوده μm 250-212 بود كه اين محدوده دانه بندي با الك كردن نمك به دست آمد.
پليمر پلي هيدروكسي بوتيرات(PHB) از شركت Aldrich و كلروفرم از شركت اسپانيائي Scharlau با خلوص %5/99 تهيه گرديد.

2-2- سنتز نانو ذرات هيدروكسي آپاتيت (nHA) نانو ذرات هيدروكسي آپاتيت، به روش سل-ژل و به صورت زير سنتز شد. كلسيم نيترات تترا هيدرات و تري اتيل فسفيت به ترتيب به عنوان منابع تامين كلسيم و فسفر مورد استفاده قرارگرفتند.
محلول يك مولار تركيبات مذكور در اتانول به طور جداگانه تهيه شد. سپس محلول كلسيم نيترات به صورت قطره قطره به محلول تري اتيل فسفيت اضافه شد. محلول تهيه شده به مدت 30 دقيقه در دماي C°25 با همزن مغناطيسي هم زده شد و در ادامه مخلوط حاصله براي يكنواخت شدن محصول به مدت چهار روز با شيكر اوربيتالي هم زده شد.
محصول به دسـت آمـده از مرحلـه فـوق در آون در دمـاي C°80 خشك گرديد. جهت حصول فاز هيدروكسي آپاتيت ماده حاصله به مدت يك ساعت در درجـه حـرارتC °550 كلسـينه شـد كـهجهت مراحـل بعـدي از ايـن پـودر هيدروكسـي آپاتيـت اسـتفاده گرديد.

2-3- تهيه داربست پلي هيدروكسي
بوتيرات/نانو هيدروكسي آپاتيت (PHB/nHA) روش تهيه داربست، ريخته گري حلال – انحلال نمك مي باشد.
براي يافتن غلظت مناسب محلول پليمري در ريخته گري حلال، غلظت هاي مختلف محلول پليمري (4، 6 و 8 درصد وزني) در 10ميلي ليتر كلروفرم در درجه حرارت C° 2±50 تهيه شد. سپس ذرات هيدروكسي آپاتيت به محلول اضافه گرديد و به مدت نيم
-494500196492

فرآيندهايمهندسياول

ساعت (3 دوره زماني 10 دقيقه اي) تحت اولتراسونيك حمامي با توان W 340 قرار داده شد. درصد نانو ذرات o، 5/2 ، 5، 5/7 و 10 نسبت به وزن پليمر بود. سپس ذرات نمك سديم كلريد به محلول اضافه و به مدت 15 دقيقه توسط همزن مغناطيسي يكنواخت شد. نسبت نمك به پليمر 70:30 ، 80:20 و90:10 انتخاب شد. مخلوط حاصله داخل پتري ديش6 ريخته شد و به مدت دو روز در دماي محيط وسپس يك روز در آون خلا قرار داده شد تا كاملا خشك شود. انحلال نمك كامپوزيت هاي تهيه شده با استفاده از شيكر اوربيتالي در آب ديونيزه و به مدت 5 روز صورت گرفت. سپس به مدت يك روز نمونه ها در آون خلا دماي محيط قرار داده شد. نمونه ها جهت استفاده به مدت يك روز دردماي محيط قرار داده شد و سپس جهت مراحل مورد استفاده قرار گرفت.

2-4- اندازه گيري درصد تخلخل براي اندازه گيري درصد تخلخل نمونه ها آنها به صورت مربع هايي به ابعاد يك سانتي متر در يك سانتيمتر برش داده شوند. ضخامت نمونه ها با ميكرومتر تعيين گرديد و حجم ظاهري نمونه ها برحسب ابعاد آن ها تعيين شد(V). وزن نمونه ها با ترازوي با دقت 0001/0 گرم اندازه گيري شد (0W). سپس نمونه ها به مدت يك ساعت در اتانول با خلوص %90 و در ادامه به مدت 12 ساعت در آب ديونيزه غوطه ور شدند. وزن نمونه ها پس از غوطه وري مجددا اندازه گيري شد (Wt). در نهايت درصد تخلخل طبق رابط زير به دست آمد:

درصدتخلخل =[(Wt –W0) / V] ×100

از هر داربست 4 نمونه از قسمتهاي مختلف انتخاب گرديد و سپس متوسط درصد تخلخل براي هر نمونه مورد محاسبه قرار گرفت(35).
از طرفي درصد حجمي تخلخل را برحسب دانسيته (ρ) وجرم مولكولي (M) نمك و پليمر طبق رابطه زير به صورت تئوري قابل محاسبه است.

= درصد حجمي تخلخل
(M/ ρ)NaCl/[( M/ ρ)NaCl+( M/ ρ)PHB]

مطالعات ساختاري داربستهاي PHB/nHA مورفولوژي و اندازه حفرات داربست تهيه شده با ميكروسكوپ الكتروني روبشي (SEM) مورد مطالعه قرار گرفت.
ميكروسكوپ مورد استفاده مدل Philips XL30 ساخت كشور هلند بود. توزيع نانو ذرات در ساختار با تكنيك طيف سنجي اشعه ايكس برحسب طول موج(WDXA) مورد بررسي قرار گرفت.

مطالعه طيف مادون قرمز نمونه ها جهت بررسي و مطالعه گروه هاي عاملي موجود در داربست هاي ساخته شده از پليمر خالص و داربست هاي نانوكامپوزيتي و همچنين برهم كنش ميان عناصر سازنده نانوكامپوزيت، از تكنيك طيف سنجي مادون قرمز استفاده شد. مدل دستگاه طيف سنج مادون قرمز مورد استفاده در اين تحقيق، Jasco FTIR- 680 plus ساخت كشور ژاپن مي باشد.

مطالعه طيف پراش پرتو ايكس جهت اثبات حضور ذرات nHA در نانوكامپوزيت و نيز به منظور تعيين اندازه ي ذرات بلورهاي نانوذرات، تكنيك پراش پرتو ايكس استفاده گرديد. اندازه بلور هاي پليمر و نانوذره با استفاده از رابطهي دباي شرر مشخص گرديد. اين رابطه به صورت زير تعريف مي شود[36]:

(t = 0.9λ/(B Cosθدر رابطه (3)، t اندازه بلورها، λ طول موج اشعه به كار رفته در آزمون، B پهناي پيك در نيمه ارتفاع بلندترين پيك و θ زاويه اي است كه بلندترين پيك در آن مشخص شده است. دستگاه طيف سنج پراش پرتو ايكس مدل Philips و پرتو kα ، α مربوط به مس، با طول موجλ=1.54Ǻ ، جهت بررسي و مطالعه بلورهاي پليمر و ذرات nHA استفاده گرديده است.

بحث و نتيجه گيري
نانو ذرات هيدروكسي آپاتيت براي اثبات تشكيل هيدروكسي آپاتيت، طيف پراش پرتـو ايكـس از پودرهاي سنتز شده گرفته شـد. الگـوي پـراش پرتـو ايكـس ازپودر سنتز شده درشكل1-الف، نشان داده شده اسـت . سـه پيـكشارپ در محدوده 35-30 = θ2 ديده مي شود كه مربـوط بـه فـاز هيدروكسي آپاتيت مي باشد.
تصوير ميكروسكوپ الكتروني عبوري ذرات هيدروكسي آپاتيت نيز در شكل1-ب نشان داده شده است. به دليل سطح ويـژه بسـيارزياد ذرات نانو، احتمال آگلومره شدن ذرات نانو بسيار زياد است.
همان طور كه در شكل ديـده مـي شـود، ذرات تاحـد ي آگلـومرهشده ولي اندازه ذرات كمتر از 100 نانومتر مي باشد.

الف

ب

الف

ب

شكل(1): (الف) طيف پراش پرتو ايكس و(ب) تصوير ميكروسكوپ الكتروني عبوري نوري ( TEM ) از ذرات هيدروكسي آپاتيت سنتز شده به روش سل – ژل.

(PHB/nHA) داربست
3-2- 1- مقادير درصد حجمي تخلخل درصد تخلخل در اين روش، به ميزان نمك مورد استفاده بسـتگ ي دارد. با افزايش درصد تخلخل، ارتباط بين حفرات بيشـتر خواهـدشد. وجود تخلخل بسيار زياد به همراه وجود ارتبـاط بـين آن هـا،براي مهاجرت سلول و انتقال مواد غذايي و دفع متـابوليكي مـوردنيازاست[6]. لذا با تغ ييـر م يـزان نمـك، درصـد تخلخـل بهينـه بـهدست خواهد آمد. درصد حجمي تخلخل كه به روش نفوذ حلالتعيـي ن شـده اسـت، درش كل2 آورده شـده اسـت. درصـد تئ ور يتخلخل 58، 70 و 84 درصد به ترتيب بـرا ي 70، 80 و 90 درصـدنمك است. همان گونه كـه در شـكل 2 مشـاهده مـي شـود اولا بـاافزايش درصد نمك، درصد تخلخل نيز افزايش مي يابد كه امـر ي طبيعي است. ثانيا با افزايش مقدار نانوذرات هيدروكسـي آپاتيـت، درصد تخلخل به مقدار ناچيزي كاهش مي يابد. ايـن امـر ناشـي ازپ ر ش دن فض اي خ الي موج ود در تخلخ ل ه ا توس ط ن انوذرات هيدروكسي آپاتيت است. اين موضـوع در سـاخت داربسـت هـايكامپوزيتي يك امتياز محسوب مي شود. زيرا اولا مطالعـات نشـانداده اس ت ك ه ب ا اف زودن ذرات هيدروكس ي آپاتي ت درمقي اس ميكرون ي، تخلخ ل ه ا بس ته ش ده و اف زودن آن را ب ا مح دوديت روبــرو مــي كنــد. امــا در ايــن تحقيــق تــا 10 درصــد نــانوذرات هيدروكسي آپاتيت به كامپوزيت اضافه شد و تـاثير قابـل تـوجهي بر تخلخل نداشته است. ثانيا اندازه ذرات نقش مهمـ ي در خـواصمكانيكي، زيست فعالي و تخريب داربست هـاي كـامپوزيتي دارد. ذرات نانو سطح ويژه بسيار بيشتري نسبت به ذرات ميكروني دارد، لذا خواص زيست فعالي بيشـتري را بـه كامپوزيـت مـي بخشـد . از طرفي استفاده از ذرات در مقياس نـانو بـه اسـتخوان طبيعـي بسـيارشبيه بوده و اين مسئله باعث افزايش استحكام اسـتخوان مـي شـود . پرامانيك7 و همكارانش[37] نشـان دادنـد كـه افـزودن نـانوذرات هيدروكسي آپاتيت به پلي لاكتيك گليگوليك اسـيد (PLGA)8 اســتحكام و ضــريب الاســتيك كامپوزيــت را نســبت بــه ذراتميكروني بيشتر افزايش مي دهد. بـه عـلاوه افـزودنnHA بـه پلـيلاكتي ك گليگولي ك اس يد س اختار حف رات منظم ي را حاص ل مــي كنــد در حــالي كــه ســاخار حفــرات پلــي ال- لاكتيــك
اس يد(PLLA)9 حـاوي ذرات هيدروكس ي آپاتي ت ميكرون ي، نامنظم مي باشد[37].

0
20
40
60
80
100
0
تخلخل

ي
حجم

درصد
2.5
nHA
وزني

٧٠
%
نمک

نمک
5
7.5
درصد
٨٠
%
٩٠
%
نمک
10

0

20

40

60

80

100

0



قیمت: تومان


دیدگاهتان را بنویسید