توليد لايه نازك كامپوزيت كراتين-كايتوسن- ژلاتين و بررسي خواص
مكانيكي و چسبندگي سلولي آن جهت استفاده در لنز و كاشت در بدن

رضا بازرگان لاري1 و افشين نعمتي2
استاديار، دانشگاه آزاد اسلامي واحد مرودشت
دانشجوي كارشناسي مهندسي مكانيك، دانشگاه آزاد اسلامي واحد مرودشت
rbazargan@shirazu.ac.ir

چكيده
فيلم كراتين- كايتوسن بهوسيله قالبگيري مخلوط اين دو بيوپليمر در اسيد استيك 75% وزني تهيه ميشود. اگر چه فيلمهاي كراتين بدون هيچ افزودني بسيار شكننده است، اما با افزودن10 الي 30 درصد وزني كايتوسن ميتوان استحكام كششي را بهميزان 27 الي 34 مگاپاسكال و انعطافپذيري و درصد ازدياد طول آن را بهميزان 4 الي 9 درصد افزايش داد. افزودن 20 درصد وزني گليسيرول نيز باعث افزايش انعطافپذيري فيلمهاي كراتين ميشود. افزايش بيشتر كايتوسن بهكراتين حاوي گليسيرول باعث افزايش استحكام كششي بهميزان 9 الي 14 مگاپاسكال ميگردد، اما اثر چنداني بر درصد ازدياد طول و انعطافپذيري نميگذارد. بر اساس اين اطلاعات ميتوان خصوصيات مكانيكي فيلمهاي كراتين را با مقادير مناسب كايتوسن، گليسيرول و ژلاتين تنظيم كرد. در اين مقاله همچنين اثر كامپوزيت كراتين-كايتوسن- ژلاتين بر چسبندگي و رشد سلولي مورد مطالعه و بررسي قرار گرفت كه نشاندهنده بهبود و افزايش چسبندگي و رشد سلولي بود. لازم بهذكر است كه اين كامپوزيت نيز بهخوبي فيلمهاي كايتوسن، خاصيت ضد باكتري از خود نشان داد. تكثير سلولي بر روي اين تركيبات نيز بررسي شد كه نتيجه آن تكثير بيشتر سلولها بر روي كامپوزيت كراتين-كايتوسن- ژلاتين نسبت بهفيلمهاي كراتين خالص
بدون هيچ افزودني بود.

واژههاي كليدي:
كراتين، كايتوسن، ژلاتين، كامپوزيت، چسبندگي سلولي، كاشت.

1- مقدمه
كايتين دومين بيوپليمر فراوان طبيعي بعد از سلولز است. اين ماده بهصورت ماده سخت روي بدن سختپوستان و برخي حشرات در طبيعت موجود است. ساختار كايتين بهصورت واحدهاي تكراري دو استاميد دو دياكسي ديگلوكز 1 ميباشد. بيشترين منابعي كه ميتوان از آن كايتين را استخراج كرد، پوست سخت خرچنگها و ميگوهاست [1].
كايتوسن از اين لحاظ يك بيوپليمر قابل توجه است كه در دسترس است و ميتواند بهسادگي اشكال مفيدي نظير غشاها، اسفنجها، فيبرها و نيز بهصورت پودر و محلول درآيد [2]. اگر درجه دياستيلهشدن كمتر از 50% باشد، اين بيوپليمر را كايتين و اگر بيش از 50% باشد، بهآن كايتوسن ميگويند. از بين اين دو پليمر، كايتوسن بهدليل كاربردهاي بيشتر در داخل و خارج از بدن در تحقيقات بيشتر مورد مطالعه قرار ميگيرد. دلايل بهكارگيري كايتوسن قابليت حل در اسيدهاي آلي و توانايي واكنش با گروه هاي هيدروكسيل و آمينو ميباشد. بهمحض تجزيه گروههاي آمينو در كايتوسن، كايتوسن پروتوندار ميشود و نتيجه يك پليساكاريد با بار مثبت است كه قابليت جذب و چسبندگي سلولي را افزايش ميدهد [3]. اين ماده بهسطوح با بار منفي بهخوبي ميچسبد و داراي خواصي نظير زيست تخريب پذيري، سازگاري با محيط زنده و كشنده قارچ است. همچنين ممكن است بتوان كايتوسن را با اصلاحاتي بهعنوان يك پليمر ضد باكتري بهكار برد. كايتوسن داراي ساختار شيميايي منحصر بهفرد است و بهخوبي گروههاي آمينو و هيدروكسيل واكنشپذير، بهصورت يك پليالكتروليت خطي با چگالي بار زياد عمل ميكند [2].
كراتين بزرگترين ساختار پروتئين رشتهاي است كه از پوشش بيروني مو، پشم، ناخن و سم، شاخ و پر پستانداران، خزندگان و پرندگان تهيه ميشود [4]. در بررسي آمينواسيد، مشخص شد كه كراتين در باقيماندههاي سيستين2 كه نوعي آمينواسيد است بهوفور يافت ميشود (در حدود 7 الي 20 درصد كل باقيماندههاي آمينواسيد) [5].
اين باقيماندههاي سيستين بهصورت باندهاي بين ملكولي دي سولفيد ميشوند كه در نتيجه آن شبكههاي سه بعدي فيبرهاي كراتين كه از لحاظ مكانيكي قوي هستند بهوجود ميآيند. ساختار انعطافپذير اما سخت كراتين ممكن است بهدليل اين خصوصيت فيبرهاي كايتوسن باشد. اگر چه تلاشهاي زيادي براي تهيه كراتين از مو و پشم انجام شده اما بيشتر اين تلاشها
فقط نوعي سيستين دگرگون شده را حاصل كردهاست
[6، 7، 8 و 9].
اگر چه فيلمهاي كراتيني كه با ريختهگري محلول كراتين بدون هيچ ماده اضافي بدست ميآيند براي جابجايي بسيار شكننده هستند، اضافه كردن گليسيرولباعث پيشرفت خصوصيات
فيلم هاي كراتين و تبديل آنها بهفيلمهايي شفاف، با استحكام نسبتاً خوب، انعطافپذير و زيست تخريبپذير ميشود.
سلولهاي فيبروبلاست موش بهخوبي روي فيلمهاي كراتين تكثير ميشود، بنابراين انتظار ميرود كه كراتين همانند كلاژن و ژلاتين يك ماده كارا در علوم پزشكي باشد. اگر چه فيلمهاي كراتين حاوي گليسيرول همانطوركه اشاره شد مقاومت و انعطافپذيري مناسبي از خود نشان دادهاند، اما گليسيرول در محيطهاي آبكي حل نميشود و باعث شكنندگي دوباره فيلمهاي كراتين ميشود [10].
كايتوسن كه شامل گلوكز آمين و ان استيلگلوكزآمين3 است يك ماده غير سمي، زيست تخريبپذير، سازگار با محيط زنده و يك پليمر آبدوست است [11]. محدوده كاربرد آن از تكنولوژيهاي محيطي، دارويي، وسايل آرايشي، كشاورزي، غذايي و بيوتكنولوژي تا شيمي است [12]. تحقيقات جديد بر روي كاربردهاي آن در علوم دارويي بهواسطه خواص ضد باكتري آن و سازگاري با محيط زيست متمركز شدهاست.
كايتوسن ميتواند در توليد رگهاي خوني، بخيههاي جراحي و همچنين بهعنوان عاملي براي التيام زخمها مورد استفاده قرار گيرد. توانايي كايتوسن براي تشكيل فيلم بهآن قابليت استفاده بهصورت پوست مصنوعي و لنزهاي تماسي را ميدهد [13].
مائو4 و گروهش بر روي خواص غشاهاي كايتوسن- ژلاتين كه با اسيد هيالورانيك5، اصلاحشده مطالعاتي انجام دادند كه اين غشاها زيست تخريبپذيري خوبي از خود نشان دادند [14].

مواد و روشها
تهيه محلول كراتين
بهطور خلاصه، 9 گرم پشم را در 100 ميليليتر آب حاوي M8/0 اوره، M62/0 سديم دو دسيل سولفات6 و دو مركاپتواتانول7 M 66/1 خيسانده ميشود. اين مخلوط در دماي 50 درجه سانتيگراد براي 16 ساعت تكان داده ميشود و سپس از ميان شبكه فولاد ضد آب فيلتر ميگردد و پس از آن محلول كراتين بدست آمده در دماي 4 درجه سانتيگراد نگهداري ميشود.
تهيه كايتوسن
كايتوسن يكي از مشتقات كايتين ميباشد كه بهوسيله چندين بار دياستيله كردن كايتين بدست ميآيد. بهطور كلي براي تهيه كايتوسن ابتدا پوست ميگو را با HCl كلسيمزدايي و سپس با NaOH رقيق پروتئين زدايي كرده و در نهايت با NaOH
40 الي 50 درصد وزني دي استيله ميكنيم.
2-3- تهيه فيلم كامپوزيتي كراتين-كايتوسن- ژلاتين
250 ميليگرم كايتوسن را با 100 ميلي ليتر اسيد استيك 75 درصد وزني در دماي اتاق هم زده تا محلول همگن توليد گردد.
سپس اسيد استيك سرد را بهميزان مناسب بهمحلول كراتين- ژلاتين اضافه و در انتها mg/ml 5/2 كايتوسن اضافه گرديد. جهت تهيه كامپوزيت كراتين-كايتوسن- ژلاتين ابتدا ژلاتين را بهمحلول كراتين اضافه نموده و سپس مقادير مختلف كايتوسن را با آن تركيب كرده و بهمدت دو ساعت در دماي اتاق بههم ميزنيم. تركيب بدست آمده را در محلول اسيد استيك (w/v) 1% حل كرده و در نهايت براي جدا كردن ذرات حل نشده از صافي عبور ميدهيم.
بعد از خشك كردن، فيلمهاي شفاف در حمام انعقاد كه حاوي 5 درصد سديم هيدروكسيد است، خيسانده ميشوند. سپس براي رسيدن به 7pH = تركيب را با آب يون زدودهشده، شسته و در آن نگهداري ميگردد. محلول كراتين-كايتوسن- ژلاتين در قالبهاي پروپيلن با مساحت كف 2cm 7 × 2 ريخته گري شده و در دماي 50 درجه سانتيگراد خشك ميشود. ضخامت فيلمهاي بدست آمده بين01/0 تا 02/0 ميليمتر است.
2-4- خصوصيات مكانيكي
منحنيهاي تنش- كرنش با استفاده از دستگاه تست كشش ديجيتال و بهوسيله اندازهگيريهاي تك محوري تعيين شدند. فيلمها بهصورت قطعات مستطيلي با ابعاد 2mm 50 × 5 بريده شده و خصوصيات مكانيكي در سرعت mm/s20 در دماي 25 درجه سانتيگراد تحت رطوبت نسبي 65% اندازهگيري گرديد. ماكزيمم استحكام كششي، درصد ازدياد طول و مدول يانگ ازپانزده آزمايش مستقل محاسبه شد.
2-5- بررسي ساختار ميكروسكوپي فيلمهاي تهيه شده ساختار ميكروسكوپي سطح كايتوسن و فيلم كامپوزيتي كراتين- ژلاتين- كايتوسن كه بهوسيله ميكروسكوپ الكتروني روبشي(8Stereoscan 250 Mk3) (SEM) تهيه شده در شكل (1) نشان داده شدهاست.
2-6- كشت سلولي
سلولهاي فيبروبلاست يك جنين هشت هفتهاي در محيط 9MEM كه از كمپاني GibcoBRL خريداري شد با 5/11 درصد خونابه گاو خريداري شده از Biosciences PTY Ltd در محل پرورش اطفال زودرس10 با 5% دياكسيد كربن در 37 درجه سانتيگراد كشت دادهشد [15]. زماني كه سلولها بهطور كامل ظرف كشت را پوشاندند با استفاده از 25/0 درصد آنزيم شيره لوزالمعده11 و با سانتريفيوژ جدا شد، كامپوزيت كراتين- ژلاتين- كايتوسن را با مقادير مختلف كايتوسن اضافه ميكنيم. ظروف كشت در محل پرورش اطفال زودرس با 5% دياكسيد كربن در 37 درجه سانتيگراد براي 48 ساعت نگهداري ميشوند.
چسبندگي و رشد سلولي بهوسيله ميكروسكوپ مشاهده گرديد.
مقادير كايتوسن در كامپوزيت كراتين- ژلاتين- كايتوسن صفر، 10، 25، 33 و 50 درصد است. كليه آزمايشات در آزمايشگاه دانشگاه آزاد اسلامي واحد مرودشت انجام شد.

نتايج و مباحث
3-1- بررسي خواص مكانيكي فيلم كامپوزيتي كراتين-كايتوسن- ژلاتين
براي تقويت فيلمهاي تهيه شده با كراتين، كراتين را با كايتوسن و ژلاتين مخلوط ميكنيم كه در آب در pHهاي اسيدي قابل حل است. درحاليكه كراتين يك پروتئين اسيدي است كه نقطه تمركز ايزوالكتريك (PI) آن بين 9/4 تا 1/6 است و در

ف
ال

ب

ف

ال

ب

شكل (1): الف) ساختار ميكروسكوپي كايتوسن و ب) ساختار ميكروسكوپي كامپوزيت كراتين-كايتوسن- ژلاتين.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
Ultimate Tensile Strength

0



قیمت: تومان